【8.3.4.3】环状RNA的制备
作为近几年兴起的突破性技术，mRNA技术通过脂质纳米颗粒（ LNP ）将mRNA导入体内来表达抗原蛋白，以刺激机体产生特异性免疫反应。新冠肺炎疫情（ COVID-19 ）爆发后，针对性的mRNA疫苗在多种疫苗类型中脱颖而出。与此同时，环状RNA（ circRNA ）以其高度稳定的结构，不需要修饰核苷酸和加帽加尾修饰等优势，逐渐走入大众视野，并迅速引发资本市场和业内研究人员的高度关注。
- circRNA分子呈共价闭合环状结构，不含5’-Cap和3’-olyA结构，不易被RNase降解，具有较高的稳定性，因而大大延长了其半衰期，从而达到低剂量长时效的目的。
- 此外circRNA因为不需要修饰核苷和加帽加尾等操作，所以还有相对简单的生产工艺优势。
与mRNA相同，前期线性RNA的获得均来自线性化质粒的体外转录，而后根据其环化工艺的不同，circRNA的人工制备大致分为三个类型：I型内含子自剪切、Ⅱ型内含子自剪切和T4 RNA连接酶。大致流程如下：
1、 模板制备
在该环节中，高质量的质粒制备尤为重要，关系到后续体外转录产物的质量。环状质粒由于无有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物。为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒需确保双链为平末端或5’端为突出结构。此外，为了使转录产物中不带有酶切位点残基序列，通常质粒线性化时需要使用IIS型限制性内切酶进行质粒酶切。GMP级生产BsaI、BspQI限制性内切酶，高效线性化质粒。
图例）50μl 酶切体系内，1U BsaI 引入量前提下，调整质粒加量进行酶切，结果显示 BsaI 可完全酶切 10μg 质粒。受质粒类型及超螺旋比例等因素影响，酶切效率有差异，需根据实际情况调整酶切体系。
2、 体外转录
作为生物大分子，RNA可采取体外转录（IVT，in vitro transcription）的方法大规模合成，T7启动子是目前转录效率最高的一类启动子，因此采用T7 RNA聚合酶进行体外转录可获得更多的合成产物，同时，T7 RNA聚合酶也是综合性能最好的RNA聚合酶，可实现大规模工业化RNA生产。实现T7 RNA聚合酶的GMP级大规模生产，配合高纯度核苷酸底物（NTPs），20μl转录体系，1μg模板投入量，可获得150-200μg产物，同时保证RNA完整性好。
图例）高活性T7 RNA聚合酶搭配高纯度NTPs，转录RNA纯度高，完整性好。
基于RNA易降解的特性，在RNA制备过程中，RNA酶抑制剂的存在是必须的。RNA酶抑制剂可与RNase A形成1：1复合体，对RNase 有极强的非竞争性抑制，保护RNA不被降解。RNA酶抑制剂，稳定性强，适配更高转录温度体系探索。
此外，RNA合成过程中，体系内会产生无机焦磷酸盐沉淀，这些沉淀会严重抑制转录效率影响RNA产量，无机焦磷酸酶可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐（P2O74-+H2O+PPase→2HPO42-），一方面可去除无机焦磷酸盐对反应体系的抑制，另一方面为反应提供热力学动力，促进产物的生成，在mRNA疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。
3、 DNA模板去除
IVT反应结束后，需要使用 DNase I去除 DNA 模板，以减少对后续反应的影响。DNase I可有效消化双链DNA模板，而对RNA无影响。
图片图例）DNase I 去除RNA样本中的DNA残留
4、 环化
如前述，环化工艺有三种不同的方法，不同的方式、不同的RNA长度都可能带来不同的环化效率。
- 以I型内含子为基础，搭配有助于剪接的辅助序列，可实现环化1500nt以上的RNA。
- II型内含子剪接有酵母菌或破伤风杆菌来源，Ⅱ型内含子的自催化剪接反应可以在体外人工制备环状RNA，利用Ⅱ型内含子的六个结构区域中的（D1-D3）以及（D5-D6）序列倒转，可以形成自剪接活性的核酶，此种方法制备的环状RNA没有外来序列的残留。
- 通过酶法环法可以避免外源序列引入导致的免疫原性，同时发展了借助内源性的夹板链实现RNA的环化。
5、 纯化
环化结束后，需要通过系列纯化手段对circRNA进行高纯度回收，由于不同环化方式的效率差异，RNase R的引入，有效去除未环化的线性RNA，从而达到纯化circRNA的目的。RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，是一种镁离子依赖性的3'—5’核糖核酸外切酶，可从3'—5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R几乎能够消化所有线性的RNA，但不易消化环状RNA、套索结构RNA和3’端突出少于7个核苷酸的短双链RNA分子。通常用来消化线性RNA以富集circRNA或套索结构RNA。近岸蛋白经过系列验证，重磅推出高活性RNase R。
RNase R针对Total RNA、ssRNA及circRNA的消化实验，实验证明， RNase R可以消化绝大部分的总 RNA样品，完全消化ssRNA样品，对circRNA样品起到良好的纯化效果。
为了进一步验证RNase R对环状RNA无酶切作用，利用qPCR方式检测经RNase R（蓝色：近岸蛋白；绿色：对照品牌）消化后的总RNA样品中hsa_circKIF12a和hsa_circVapa基因的丰度变化，结果显示，与阴性组（橙色）相同，两个基因的丰度基本没有变化，而经RNase A（粉色）消化的样品中基因丰度明显下降，表明环状RNA耐受RNase R的消化。
随着序列设计的不断优化，环化工艺的进一步探索，伴随circRNA的各项技术壁垒也将会逐步打破。国外以ORNA Therapeutics和Laronde为代表，国内环码生物、科锐迈德、圆因生物、奥明基因等公司先后成立布局circRNA，越来越多的研发管线来满足临床治疗需求，circRNA未来可期。
参考资料
