【8.3.3.1】Clean-PIE
环状mRNA因为其无需加帽加尾的闭环结构，体内外更稳定，表达时间更长，制备工艺更简单，成本更优，有望成为线性mRNA的替代者，开启mRNA 2.0时代。
2022年6月21日，苏州科锐迈德生物医药科技有限公司（以下简称科锐迈德或CureMed）在预印版bioRxiv发表题为：Clean-PIE: a novel strategy for efficiently constructing precise circRNA with thoroughly minimized immunogenicity to direct potent and durable protein expression的研究论文
新的Clean-PIE成环策略巧妙地通过筛选蛋白编码区或者IRES区找到了最优的成环位点，通过蛋白编码区或者IRES区连接成环实现了无外源序列引入，且具有环化效率高（＞90%）、序列精准的特点，同时通过该方法得到的环状RNA免疫原性比ORNA所得到的环状RNA更低，且表达效率高，表达时长持久。该研究还建立了一套剪接位点自动化预测筛选系统，针对不同序列进行高效计算。另外，值得一提的是，该研究建立了高效IRES元件筛选系统，通过筛选600余条IRES序列，得到20多条新的优于CVB3表达的IRES序列。
环状RNA（circular RNA, circRNA真核生物体内是由反向剪接（back-splicing）过程产生的共价闭合环状RNA。1976年，Sanger首次在类病毒中发现了单链共价闭合环状的RNA分子，但是很长时间以来一直被认为是细胞内mRNA错误剪接的产物，并没有实际的功能。90年代末期到20世纪初，多项研究发现多种基因可以产生circRNAs。进入2010年以后，随着RNA-seq技术的发展，引爆了circRNA 研究。2017年，几个课题组相继报道了circRNAs能够在真核生物体内以帽子独立（Cap-independent）的方式翻译。
在circRNA最终走向临床应用过程中，多个关键难题摆在我们面前亟待突破：
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如何实现circRNA高效精准环化？
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如何避免外源序列引入带来的免疫原性？
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如何实现circRNA高效组织特异性的表达蛋白？
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如何获得高纯度circRNA，避免precursor和nicked RNA等杂质干扰？
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如何实现稳定量产工艺放大？
目前体外RNA环化策略主要3种：化学方法，连接酶方法（T4 RNA ligases），核酶方法（groupⅠ、groupⅡself-splicing introns）。连接酶和核酶方法最为常用
- Method I：T4 RNA ligase连接
- Method II：group I、group II intron 自剪接
- Method III：Clean-PIE 系统，group I intron自剪接
一、I型内含子自剪接
MIT Daniel. G. Anderson2研究组通过工程化改造鱼腥藻（Anabaena）I型内含子实现了体外长编码RNA的环化，在镁离子和GTP存在下，发生两次酯交换反应，形成环状RNA。通过优化经典的鱼腥藻PIE ，通过增加同源臂(homology arm)、间隔序列(spacer)，解决长编码RNA序列成环的难题，并且能够得到较好的成环效率。另外一方面，通过HPLC纯化策略以及IRES序列筛选增强了circRNA在细胞内蛋白表达的稳定性和效率。这种成环策略由于增加了间隔序列且外显子序列较长，所以需要在最终的环状RNA产物中额外引入186nt碱基序列。
二、II型内含子自剪接
II型内含子（group II intron）存在于原生生物、真菌以及细菌基因组中。在体内II型内含子可通过两步连续的转酯反应从前体RNA中自剪接，并连接两侧外显子，许多II型内含子的剪接反应是由蛋白质辅助完成的。同时II型内含子也被证明可以在体外通过自我催化发生剪切反应。
如下图所示，采用破伤风杆菌group II intron自催化剪接反应，引入IBS1和IBS3短的外源序列，或者通过控制内含子插入过程中与外显子配对的EBS序列可改变RNA靶点，这种经过修饰的II类内含子称为“targetron”。通过这种方式设计的破伤风杆菌II型内含子和酵母菌II型内含子剪接系统可以做到无外源序列残留的circRNA人工体外制备5。如下图所示，成环效率有待提高，并且成环条带中含有的nicked RNA 需要进一步鉴定。
三、T4 RNA ligase
T4 DNA/RNA ligase 体外连接成环的方法可以避免如上外源序列引入导致的免疫原性。但是，T4连接酶相对低效的连接效率和需要借助DNA夹板序列辅助的成环方法，使其很难实现工业化制备；该方法也发展了借助内源性的夹板链实现RNA的环化3,6。如下图所示：
其二，T7 RNA 聚合酶在转录过程中会在3’末端随机引入1-3个额外的guanine（G）1，使得T4 RNA ligase的方法应用于IVT体外转录的RNA成环时获得的序列不准确；
其三，T4 RNA 连接酶催化单链 RNA分子间和分子内5'-磷酸基团和 3'-羟基末端形成磷酸二酯键，体外转录后需要RNA链5’末端预先去磷酸化，操作繁琐且成环效率不高。如下图所示：
四、Clean-PIE group I intron自剪接系统
ORNA group I intron Ana PIE成环策略引入186nt外源序列带来的免疫原性，破伤风杆菌和酵母菌group II intron体外较低的剪接效率，T4 RNA ligase成环方法序列不准确性和操作繁琐都是制约环状RNA应用于临床的壁垒。
2022年6月21日，CureMed发表在预公开平台bioRvix上的文章，公开了一种新型的Clean-PIE的环状RNA成环策略。该研究巧妙地通过筛选蛋白编码区或者IRES区找到了最优的成环位点，通过蛋白编码区或者IRES区连接成环实现了无外源序列引入的RNA成环连接
同时，该研究还建立了一套剪接位点自动化筛选优化系统。通过针对不同序列进行高效计算优选出最佳的成环位点。通过对大肠杆菌或者人类基因组内所有大于500bp的基因进行评测，发现通过优化系统可以在99.9%的H. sapiens 基因和100%的E.coli的基因中筛选的到13分以上的成环位点（即与最优成环序列只相差一个碱基）。这证明了该成环策略具有普适性。
同时该研究优化了环状RNA的序列构成，通过添加polyAC序列提高了环状RNA的表达。
Clean-PIE系统的优点在于无外源序列引入，成环序列精准。该文章研究数据表明，相较于ORNA成环策略，转染Clean-PIE环状RNA的细胞内IFN-β、RIG-1、IL-6、MDA-5表达更低，体外细胞水平蛋白表达也明显优于ORNA。
另外，为了实现circRNA高效组织特异性的表达蛋白，该研究建立了高效的IRES筛选平台，已经筛选了600余个IRES序列，其中20余个IRES元件表达量显著高于CVB3，并初步掌握了IRES组织特异性表达的数据。
参考资料
