【9.4.1.3】dsRNA产生的过程
为了确保重复或长期给药的治疗应用的高 mRNA 纯度，需要几个资本密集型且耗时的纯化步骤。这些额外的单元操作通常会导致 RNA 降解增加、质量下降和/或产量下降，这凸显了对更有效的合成工艺的需求，以减少下游纯化步骤的杂质负担。
IVT 是一种用于合成 mRNA 产品的酶促过程。在IVT期间，RNAP （RNA polymerase） 负责从DNA模板转录RNA。尽管 IVT 是研究实验室公认的工艺，但工业规模生产的优化最近才开始
IVT 最常用的聚合酶是 T7 RNAP，这是一种 99 kDa 的酶，包含氨基末端结构域（NTD，amino-terminal domain；残基 1-266，图1色带）和羧基末端结构域（CTD，carboxy-terminal domain；残基 267-883，图 1）。 .1灰色表面）。它在研究和商业开发中的受欢迎是由于它适用于体外 RNA 生产、其高产率和所产生的转录本的高保真度 。然而，T7 RNAP 也会产生多种副产物，包括由产物模板转录产生的免疫刺激性双链 RNA (dsRNA)；这些可能会影响效力和安全性，特别是在治疗应用中
a，T7 RNAP 在催化过程中呈现两种不同的构象状态：IC 和 EC。 b，在IC中，T7 RNAP结合T7启动子并生成短RNA或失败的转录物（2-10个核苷酸），直到它转变到EC中；这种转变可能需要多次启动才能成功。产生的短RNA可以通过RNA模板转录与T7 RNAP相互作用，产生短dsRNA。只有在转变为 EC 后，T7 RNAP 才具有高度持续性并能够生成全长 RNA。作为一种酶，T7 RNAP 可以催化数百个全长 RNA 拷贝的形成。这些全长分子也可以用作 T7 RNAP 的模板，以生成长环回 dsRNA 种类。两种类型的 dsRNA 杂质在体外和体内均具有免疫刺激作用。
IVT 期间 dsRNA 和其他副产物的产生受到催化循环期间 T7 RNAP 构象的影响。 T7 RNAP 介导的转录包含三个不同的阶段：起始、延伸和终止。
- 在启动过程中，T7 RNAP 的 NTD 与启动子序列结合，形成启动复合物（IC；图1a）。该 IC 不稳定，会产生长度为 2-10 个核苷酸的短 RNA 转录本，称为流产转录本（abortive transcripts ），这一过程称为流产循环（abortive cycling）（图1b）。
- 一旦转录物长度大于~10个核苷酸，NTD中的启动子结合残基就会重新排列，释放DNA启动子区域并形成稳定且持续的酶延伸复合物（EC ；图1a）。
- 终止反应要么是响应特定的信号序列，要么是在到达线性化 DNA 模板的末端时发生，这一过程称为“径流转录”（run-off transcription），通常会产生全长 RNA，但有时会导致 3' 末端出现非模板添加（图1b )。
T7 RNAP 还具有隐秘的 RNA 模板转录能力，导致 dsRNA 产物和环回 dsRNA 产物的形成（图1b）。 3' 异质性和环回转录背后的确切机制仍然未知。因此，设计合理的方法来防止这两种活动都是具有挑战性的。
众所周知，dsRNA 分子是先天免疫反应激活剂，能够触发内体中的 Toll 样受体 3 和细胞质中的视黄酸基因 I 样受体，如 RIG-I、MDA5 和 LGP2。因此，此类 dsRNA 分子会影响 mRNA 产物的效力和安全性，因此需要额外的纯化步骤以从最终 mRNA 产物中去除 dsRNA。制造过程中通常使用两种方法来减少 dsRNA 负担。一是使用色谱法纯化 mRNA 产物，例如反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 或基于纤维素的 dsRNA 分离；另一个是修改 IVT 条件以减少副产物的形成。虽然可以有效减少 dsRNA 负担，但改变 IVT 条件并不足以消除通过 RP-HPLC 下游纯化 mRNA 产物用于治疗应用的需要，这是一个昂贵且耗时的步骤。
在此，我们报告了双突变 T7 RNAP (G47A + 884G) 的鉴定，该双突变 T7 RNAP (G47A + 884G) 可显着减少 dsRNA IVT 副产物，同时保持 RNA 产量和纯度，从而减轻下游纯化过程控制转录相关 dsRNA 杂质的负担。
参考资料
- https://doi.org/10.1038/s41587-022-01525-6. An engineered T7 RNA polymerase that produces mRNA free of immunostimulatory byproducts
