【9.1.4】酶加帽法

mRNA 5' Cap加"G"的反应是非常迅速的，很难在体内测到5’自由三磷酸基因的存在。据测算，在新生mRNA链到达50个核苷酸之前，甚至在RNA polymerase II离开转录起始位点之前，Cap就已经添加到mRNA第一个核苷酸上了。也就是说，真核mRNA几乎从一出生，就头顶帽子结构了。

mRNA加帽过程可以分为三个过程:

1. RNA 5' triphosphate 移除一个磷酸基团形成diphosphate-RNA
2. RNA guanylyltransferase 把GMP转移到diphosphate-RNA，形成帽子结构
3. RNA guanine-7-methyltransferase利用SAM作为甲基供体，在鸟嘌呤核苷酸N^7^位置上形成m^7^G cap

Celluar mRNA加帽过程

在真菌和动物细胞中，guanylyltransferases 和cap methyltransferases 在结构和机制上是高度保守的，但是RNA triphosphatases是完全不同的。

我们可以看到真核细胞中mRNA加帽反应涉及到三个过程，需要三种不同的酶。但是在体外合成mRNA时，我们用到的是牛痘加帽酶。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5’末端（m7Gppp5’N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，并且保证正确的方向。

参考资料

• https://mp.weixin.qq.com/s/B2-ChprL24MPBipxbWmHDQ