【3.8.1】mRNA药物的生产工艺(MOD)

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本文将介绍mRNA疫苗生产的一般工艺，以由约2000个核苷酸(nt)组成的新冠病毒刺突蛋白基因表达为例。但是，本工艺可用于构建和纯化任何mRNA疫苗。工艺分为:

  • 转录反应
  • mRNA转录物的纯化
  • mRNA制剂至脂质纳米颗粒(LNP)
  • 包装。包装步骤包括将产品灌装成小瓶，并将其放入中间存储。由于无菌条件下的全自动包装是目前最先进的方式。

一、一般工艺流程

1.1 体外转录

mRNA的产生是通过所谓的体外转录(IVT)以及共转录加帽进行的。体外转录(IVT)与共转录加帽是mRNA产生的工艺步骤。转录的关键元件是线性化DNA模板。它包含了之后在体内翻译产生所需蛋白质的必要信息。为了提高转录反应的选择性和产量，我们采用了商品化的线性化双链DNA作为模板。DNA扩增通常通过发酵或聚合酶链反应进行。基于发酵的DNA必须进行大量纯化处理。此外，所需的DNA量易于现场存储，无需现场扩增。

DNA模板示意图

上图所示为DNA模板示例，其可分为不同的序列，从左边的启动子(P)开始，接着是一个非翻译区(UTR)。继续往右看，所示为目的基因。这个区域随后将在人体细胞中编码目的蛋白质。再之后为一个UTR和poly(A)尾。DNA模板以终止子（T）结束。除了DNA模板的重要性外，其它的原材料对于mRNA的产生也是必不可少的，这些原料包括三磷酸核苷酸、CleanCap® (Cap1)、聚合酶，它们混合在一起，并在缓冲溶液中稀释。

mRNA示意图

聚合酶是生成上图所示mRNA的酶。该任务通常使用T7聚合酶来完成。它与DNA模板的启动子(P)结合并开始延长。mRNA通过延长而形成，在另一端的尾部附着一个帽分子。对于所谓的共转录加帽，可以使用具有帽1结构的商业化试剂CleanCap®。其它的共转录方法，如反逆转录帽类似物 (ARCA)，只会形成帽0结构。不同之处在于帽0的进一步甲基化形成帽1结构。一种酶反应可以将帽 0结构转化为帽 1结构，但这将导致工艺延长，而使用CleanCap®可以避免这一过程。与其它产品相比，CleanCap®的额外优势是更高的效率和更大的加帽mRNA产量。聚合酶与完成的mRNA在终止位点分离。UTR、尾和帽结构对mRNA具有重要意义，因为它们可以提高mRNA在细胞中的翻译效率和稳定性。因此，可以在体内获得更高的蛋白质产量。然后，产生的mRNA被转移到下游工艺。

1.2 mRNA纯化

从反应器获得mRNA与一系列的其它成分一起稀释在转录缓冲液中。功能完整的mRNA转录物的浓度约为5 g/L。杂质包括反应中使用的酶以及添加到反应中的缓冲成分和残留的核苷三磷酸(NTP)。在市售的酶制剂中可能存在其它的蛋白质杂质。此外，在反应过程中还会出现两种主要的杂质，即：

  • 短终止RNA转录物（或称流产转录/无效合成， short abortive RNA transcripts）
  • 双链(ds)RNA。

流产转录物（Abortive transcripts）一般长度 9 nt，比所需的mRNA要小几个数量级，相对较容易去除。由于dsRNA的分子量与全长单链mRNA的分子量相似，因此去除dsRNA的难度更大。另外比较少见的一种情况是，聚合酶可以在不存在启动子的情况下退火到DNA模板，产生与目标RNA互补的RNA链。互补RNA会退火至一些产物分子，产生dsRNA。虽然这些罕见的情况在总体质量平衡中并不明显，但去除痕量的dsRNA仍至关重要，因为它会引发人体固有的免疫反应，降低疫苗的效力。

mRNA的下游工艺包括切向流过滤(TFF， tangential flow filtration)、层析（chromatography）以及随后的第二次切向流过滤（second tangential flow filtration）。第一个TFF步骤参考了专利[WO2014140211A1]，其使用TFF装置，在单个1小时的步骤中，对料液进行纯化、浓缩和缓冲液置换，其顺序与小规模生产中的步骤一致。作者采用改性聚醚砜膜，并建议其截留分子量 (MWCO) 不超过产物分子量的2/3。对于长度为2000 nt (分子量约为640kDa) 的mRNA序列，最常用的MWCO为300kDa。因此，一些蛋白质杂质，如RNA聚合酶(100 kDa)，至少在这一步将部分去除。专利[WO2014140211A1]中报道的跨膜压力为14 kPa（~2psi），可以很容易地通过蠕动泵产生。

TFF的回流液使用层析柱进行进一步的纯化。在保守情况下，使用AC(亲和层析， affinity chromatography )柱。由固定的Oligo-dT结构组成的亲和填料选择性地结合到mRNA的Poly-A尾，其已可商业化提供。填料制造商对这种层析柱的操作条件给出了全面的说明。层析柱装柱和平衡后，在高盐浓度和50-150cm/h的线速度下进行上样。杂质用较低的盐浓度从柱中漂洗出来，最后，产物以较低的盐浓度洗脱。在专利[WO2014152031A1]中给出oligo-dT 亲和层析的收率为92%。

阴离子交换层析 (AEC，Anion Exchange Chromatography) 是一种比较便宜的层析方法。AEC填料一般比亲和填料便宜，工艺流程的复杂性也相似。分离机制是基于RNA带负电荷的主干连接到带正电荷的基团，这些基团被固定在填料上。一些研究已经成功地将AEC用于RNA的纯化。此外，该方法似乎可以选择性地从dsRNA中分离产物。专利[US10590161B2]给出了关于如何操作AEC来实现这一点的全面说明。值得注意的是，有文献报道的AEC收率在72 - 90%之间，如果以该结果与亲和层析比较，较低的收率可能导致成本增加，较高的收率则可能节省成本。

最后，进行第二步TFF，其概念上与第一步TFF相同。但其假定，在亲和层析后，前文所述的所有杂质已从产物溶液中去除。所以，二级TFF的唯一目的是按后续处理步骤的要求，置换缓冲液。

1.3 制剂

由于mRNA分子的稳定性较低，且RNAse广泛存在，通过包封来保护mRNA是实现疫苗的全部潜力不可或缺的步骤。通过包封提高稳定性的结果在于两个方面。

  1. 首先，由于更好的热稳定性，包封可提高壳体的寿命。
  2. 其次，在体内过早降解的现象被抑制，极大地增强了机体细胞对mRNA疫苗的摄取。

如下图所示，脂质纳米颗粒(LNP)是目前最先进的mRNA载体。在图中，离子化脂质分子用橙色表示，而mRNA用红色的卷曲线表示。

脂质纳米颗粒示意图；红色 – mRNA；橙色 – 离子化脂质；蓝色、绿色和黄色 – 其它辅助脂质

mRNA与离子化脂质分子形成复合物，与它们带正电荷的末端相互作用。在产生的复合物中，脂类的疏水末端向外。蓝色、绿色和黄色标示的辅助脂质附着在疏水端，形成稳定的脂质体。脂质的组成是根据发表的研究文章和Precision Nanosystem的推荐选择的。脂质比例接近已获批的Moderna COVID - 19疫苗中的脂质比例。脂质的摩尔比为50:10:38.5:15(离子化脂质:DSPC:胆固醇:PEG2000)。

制剂过程可以使用不同的方法。Reichmuth等人已经证明了通过流体混合步骤形成LNP的可能性。首先，准备干净的mRNA缓冲溶液和乙醇溶液，其中脂质被稀释。然后，通过混合，mRNA和脂质将形成所需的纳米颗粒。然后，通过切向流过滤（TFF）去除乙醇。包封的mRNA疫苗的最后一步工艺是除菌过滤，这是一个法规要求步骤。使用孔径约为0.2μm的过滤器，所需疫苗进入滤液，微生物等杂质在过滤器中被捕获并随其丢弃。随后，质量控制是必不可少的，如下文所介绍。

1.4 质量控制

根据当前的监管机构要求，在整个过程中必须采用不同的质量控制步骤，以确保产品的纯度和完整性。到目前为止，美国食品和药物管理局(FDA)以及欧洲药品管理局(EMA)还没有就通过IVT生产的RNA疫苗给出具体规定(原文发表时间为2021年4月)。因此，质量控制步骤是为目前的工艺定制的，并考虑到了前文中提到的可能杂质。含有纯化裸RNA的二级切向流过滤的流出物将经过一系列质量控制步骤，确保没有任何不必要的化合物。DNA的存在与否可以通过使用荧光染料来证明。此外，利用紫外吸光度来量化总核酸含量，在没有DNA的情况下即等于RNA含量。如果酶仍然存在于溶液中，紫外吸收将显示额外的特征性吸光度最大值。最后，使用斑点印迹可以证明dsRNA存在与否。如前文所述，dsRNA可诱导产生免疫反应。相关抗体可作为印迹法的第一抗体在市场上获得。所列的质量控制步骤，特别是与印迹相关的等待时间，可以在工艺过程中并行进行。

为了控制终产品的质量，可采用动态光散射测量LNP的粒径。最后，通过在Triton-X缓冲液中溶解破坏LNP后，可在凝胶电泳中对部分终产品进行分析，以验证RNA的完整性以及来自制剂或包装过程的主要杂质是否有残留。如果当地监管机构有要求，还可以使用高效液相色谱(HPLC)代替凝胶电泳，以进行分析。

二、 基于容器的流程设计 Design of the Container-Based Process

三、流程分析

参考资料

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