【9.3.2】多任务polyA尾巴--核RNA成熟、降解和输出

polyA（pA）尾部是在其新陈代谢的不同阶段添加到多种RNA的3’端的必不可少的修饰。 在这里，我们描述了聚腺苷酸化的主要来源，并概述了它们在啤酒酵母，人细胞以及裂变酵母粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的核内的潜在生化相互作用。 由酿酒酵母Trf4 / 5酶及其人类同源物PAPD5 / 7介导的聚腺苷酸化通常导致非编码RNA的3’端修剪或完全衰变。 相比之下，规范性pA聚合酶（PAP）的主要功能是产生稳定且具有核输出能力的mRNA。 但是，这种二分法变得越来越模糊，至少在粟酒裂殖酵母和人类细胞中，由规范性PAP介导的多腺苷酸化也可能导致转录物衰减。

一、前言

RNA 3’末端的polyA（pA）尾是在1970年代发现的在真核和原核转录本上均发生的转录后修饰[1-5]。已发现，经典的pA聚合酶（PAP）介导的真核mRNA的聚腺苷酸化会导致长聚腺苷链的产生，并最初显示出对转录本稳定性，加工，核输出和翻译的贡献[6,7]。另一方面，原核RNA pA尾巴被发现更短，仅存在于RNA群体的一小部分，这使得它们的最初研究更加繁琐[6,8,9]。此外，显示出原核pA尾部主要参与RNA的降解和质量控制，除通过细菌PAP产生外，还通过多核苷酸磷酸化酶（PNPase）在降解和重烯基化的顺序过程中产生。后来发现酿酒酵母Trf4 / 5-Air1 / 2-Mtr4聚腺苷酸化（TRAMP）复合物可通过添加短而使一系列转录物不稳定，从而使真核和尾巴pA-tail生物学之间的明显鸿沟大大缩小。 “细菌样”的oligoA尾巴，将RNA靶向3'-5’核酸外切核外泌体复合物[10-12]。此外，现在清楚的是，pA结合蛋白（PAB）可以参与酵母和哺乳动物中具有较长pA尾的转录物的降解[13-19]。在这篇综述中，我们集中于pA尾巴在酵母和人类细胞中的核作用，以及它如何将RNA引导到不同的命运，这取决于其合成动力学，其长度和相关因素的背景。

二、pA尾巴刺激mRNP的形成和核输出

2.1（a）寻找卵裂位点

mRNA 3’末端的裂解和聚腺苷酸化是真核蛋白质编码基因座转录终止过程的一个固有部分，由酿酒酵母中一个称为裂解和聚腺苷酸化因子（CPF）的保守复合体进行操作，裂解和聚腺苷酸化特异性因子（ CPSF）。 CPF / CPSF的多亚基性质赋予复合物RNA结合，RNA核酸内切酶，蛋白质磷酸酶和PAP活性（详细信息，图1a）。在酿酒酵母中，CPF由切割因子I（CFI）复合物辅助，而在人细胞中的这种活性在切割刺激因子（CstF）与切割因子I和II（CFIm / CFIIm）之间划分。这些CFI样复合物与RNA聚合酶II（RNAPII）和新生RNA双重相互作用，这有助于正确选择RNA裂解位点[20,24,25]。酿酒酵母编码一种称为Pap1的PAP酶，而人类细胞中的这种活性分为α/γPAP（PAPOLA和PAPOLG）和最近发现的Star-PAP（TUT1）。另外，人类细胞编码睾丸特异性PAPOLB蛋白。所有这些酶都与CPF / CPSF的Cft1 / CPSF160亚基结合（图1a）。 Pap1及其直系同源物PAPOLA / PAPOLG也与Fip1 / FIP1接触，这对于调节PAP的合成能力尤为重要[26,27]。相比之下，Star-PAP与酵母Ysh1核酸内切酶的CPSF73直向同源物相互作用[28,29]。

图1

裂解/聚腺苷酸化过程通过将CPF / CPSF及其相关复合物募集到新生RNA内的pA位点和RNAPII的C端结构域（CTD）来启动。最佳pA位点序列的性质因物种而异，但通常由几个短基序组成，为了有效地募集3'-末端加工复合物，需要在空间上顺序且严格分开。在人类细胞中，切割位点位于AAUAAA六聚体共有序列与富含GU / U的下游序列元件（DSE）之间。 pA位点的强度还取决于其他上游富U元素和下游富G元素。在酿酒酵母中，该共有基序的组织方式不同，其RNA裂解位点位于两个富含U的序列之间，并由富含上游A和AU的元件辅助[24]。 Pcf11 / PCF11与RNAPII的相互作用进一步促进了CPF / CPSF向pA位点的募集（图1a）。总而言之，这些事件导致Ysh1 / CPSF73介导的RNA内切。 pA位点经常退化，并顺序出现几个基序，因此一个基因座可以产生具有不同3’端的RNA同工型，通常表现出不同的半衰期和定位。在人类细胞中，PAPOLA / G或Star-PAP可以优先使此类同种型聚腺苷酸化

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五、pA尾巴状态如何帮助区分不稳定RNA和稳定RNA？

在这篇综述中，我们描述了两个相反的结果，这是由于在RNA的3’端添加了pA尾巴所致。

• 一些腺苷酸化事件与核酸外切酶介导的3'-末端成熟或降解相关，
• 而其他一些则促进RNA的稳定及其向细胞质的输出。

因此，一个关键问题是，如何将预定用于核输出的RNA（如mRNA）与通常降解的RNA（如PROMPT，PCPA RNA [119]和CUT）区分开来。酿酒酵母进化出了一种优雅而独特的系统，其中隐秘的转录物被特异地终止，并被专用的NNS复合物标记为TRAMP /外来体降解。然而，这在人和粟酒裂殖酵母细胞中似乎是不同的，其中编码和至少一些隐秘的转录本是由CPF / CPSF途径进行3’端处理的。因此，具有出口能力的RNA和经过核降解的RNA之间的差异必须在于蛋白质向这些RNA的差异募集。然而，尽管仍未充分探讨该问题，但似乎出口和降级因素的差异招募并未完全提供答案。首先，据推测PAXT亚基PABPN1作为CPSF复合物的内在成分被募集到所有这些RNA，其次，NEXT复合物的RBM7亚基似乎也结合了所有新生RNA [120]。因此，其他特征必须有助于选择RNA进行衰变。这里要考虑的是transcript长度。与它们的mRNA对应物相比，酿酒酵母的CUT，人类PROMPT和PCPA转录本都很短。对于CUT，此功能在促进其转录终止中起关键作用，因为Nrd1结合在丝氨酸5个残基处磷酸化的RNAPII CTD，这是早期转录活性的标志。从概念上讲，类似的机制可能是通过CBC在人细胞中起作用的，该CBC物理上靠近短PROMPT / PCPA RNA的3’端，并可能通过其通过CBCN复合物有效募集RNA外来体而引起降解（图2b）。 [70]。

但是，这种短转录物的降解可能性确实没有解释如何发生长转录物的核衰变，后者由CPSF途径终止并受PABPN1约束。因此，提出了一种“核定时器”模型，表明PABPN1与新合成的RNA结合最初会产生保护作用，而仅当RNA在核中的停留时间延长时才促进衰变，从而为RNA外来体募集提供了足够的时间[ 121,122]。几种机制，例如出口动力学或剪接，可能有助于选择性保留核。除了特定的高表达基因（激活后可能会向NPC转移）外，大多数mRNA在染色质间基质内随机扩散直至到达核出口[124]。因此，一些转录本可以在细胞核中停留足够长的时间以成为衰变的靶标。人体系统研究表明，各种mRNA表现出不同的核输出速率，并且取决于细胞类型和环境条件，某些mRNA在细胞核中的驻留时间可能比在细胞质中的更长，这被认为在减少转录噪声中起着一定的作用。来自基因激活爆发[125]。选择性成绩单保留的确切机制方面仍然难以捉摸，但也可能与未经充分动力学处理而未正确加工的成绩单的降解有关。导致核保留时间延长的一个明显特征是拼接。在酿酒酵母中，NPC通过位于孔复合体核面上的Mlp1和Mlp2蛋白积极参与将未剪接的mRNA保留在细胞核中[82]。尽管尚未报道在人类系统中会发生这种情况，但已显示内含子切除可刺激RNA输出[126]。此外，一些具有核定位的处理不善的转录本在过表达显性负性PABPN1突变体的细胞中得以稳定[127]，这表明缓慢的剪接可能导致PABPN1介导的核保留和降解。

pA尾巴本身的长度也可能是促进核保留的关键因素，因为腺苷链的关键长度对于促进出口是必不可少的[49]。在酿酒酵母中，注定要进行核衰变的CUT平均短尾，这是由于Trf4合成能力低以及TRAMP复合物与外泌体的物理相互作用造成的。人PAP在其聚腺苷酸化活性的早期以及募集PABPN1之前是一种分布酶。此功能可能会导致仅带有短pA尾巴的一部分RNA形成，这将更易于衰减。因此，很容易推测某些不稳定的人ncRNA的聚腺苷酸化可能受到负调控，以进一步促进其衰变。该调节可能取决于序列元件。当RNA模板富含U时，FIP1蛋白在刺激PAPOLA活性方面最有效。以类似的方式，其他与CPSF相关的蛋白质，例如CFIm，CFIm68和CFIm59，具有以序列特异性方式结合RNA的能力，并且它们的募集调节了替代性多聚腺苷酸化过程中的Fip1功能[35]。聚腺苷酸化效率还可能受到其他活动（例如剪接）的影响，剪接已显示出它可以刺激3’末端加工[35,128-130]。通过与丝氨酸2磷酸化的RNA和RNAPII CTD结合，CPSF复合物被募集到新生的RNA中[131]。因此，还可能尚未以强力的丝氨酸2磷酸化状态为标志的，尚未进入生产性延伸状态的聚合酶不支持形成完全有能力的聚腺苷酸化机制。进一步的研究将表明，聚腺苷酸化过程的这些方面中的任何一个都不能解释发往核衰变的转录本的不稳定。

聚腺苷酸化是一个3’末端修饰，它可以指导RNA命运趋向于稳定，输出或加工以及衰变，具体取决于其产生的环境。 TRAMP介导的腺苷酸化总是与核酸外切偶联，而CPF / CPSF A尾巴可能导致输出或衰变，具体取决于尚不清楚的机制。尽管CPF / CPSF目标的某些决定性潜力似乎与PAB有关，但同等重要但探索程度较低，PAP活性的负面调节可能会发挥作用，从而可能影响出口效率并为核衰变留出更多时间。

其他

PolyA的作用：

高度保守的多腺苷酸化位点(AAUAAA)后10-30碱基位点处加上不同数量的腺嘌呤，形成polyA尾巴。核内hnRNA3’端也有polyA结构，并且比mRNA略长，平均长度为150-200个核苷酸，这表明了RNA转录后修饰的加尾过程早在核内已经完成。

[0003]这种polyA加尾的功能也不很明确，但可以从以下几方面得到启示：1)多聚腺苷酸化可被类似物3’-脱氧腺苷所阻止。这种阻止作用并不影响核hnRNA的转录，但可阻止细胞质中出现新的mRNA。这表明多聚腺苷酸化对mRNA成熟是必要的。2)珠蛋白mRNA上的polyA尾巴被去除后，仍然能在麦胚无细胞系统中翻译，显示该尾部结构并不是翻译必需；然而去除polyA尾巴后的mRNA稳定性明显降低，翻译效率下降。当mRNA由细胞核转移到细胞质中时，polyA尾巴常有不同长度的缩短。由此可见，polyA尾巴至少起着某种缓冲作用，防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解作用。3)polyA尾巴与相关蛋白的结合促进mRNA由核向质的转移。

[0004]mRNA进入细胞质后，polyA尾巴的“命运问题”更是缺乏明确的解释。polyA准确的以何种方式降解，是单个腺嘌呤逐一去除，还是随机去除？那么细胞质中是否存在不同长度的polyA片断分子？我们结合相关研究进展和自身工作基础，涉及并合成了不同长度的polyA RNA分子，依靠脂质体转染入细胞中，得到了polyA RNA分子在外源基因表达调控相关信息，并实施于抑制外源基因表达的应用中。

[0017] The term “polyA” as used herein, refers to a signal sequence which causes cleavage at a specific site at the 3' end of the eukaryotic mRNA and post-transcriptional incorporation of a sequence of about 100-200 adenine nucleotides (polyA tail) at the cleaved 3' end. The polyA refers to the consensus sequence AATAAA about 10-30 nucleotides upstream of the cleavage site and a sequence located downstream. Various polyAs are known such as tk polyA, SV40 late and early polyA or BGH polyA.

实验结果：

1. polyA长度达到60时明显抑制外源GFP的表达，并且表现mRNA水平的降低。
2. 60A对于内源GFP的表达与对照比较无显著差异
3. polyU，polyG，polyC不具备这种抑制作用，为polyA特性。

参考资料

• The multitasking polyA tail: nuclear RNA maturation, degradation and export. https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rstb.2018.0169
• CN1876814A Design and preparation of certain-length single chain polyA RNA molecule and application thereof
• EP2418282A2 METHOD FOR SELECTING A HIGH EXPRESSION RECOMBINANT CELL LINE