【8.3.1】RNA的体外环化

近年来，人们对环状 RNA（circRNA）作为一种新型内源性非编码 RNA 的兴趣日益浓厚。CircRNAs 存在于所有生命王国中；从古生菌到人类，已经发现了数千个物种。CircRNAs 长期以来以病毒植物病原体或肝炎病毒的基因组形式为人所知。此外

• circRNA 可以由内含子形成（因此称为环状内含子 RNA (ciRNA, circular intronic RNA)
• 由含有内含子的外显子形成（称为外显子-内含子 circRNA (IEciRNA,exon-intron circRNA)

然而，绝大多数 circRNA 显然是并从蛋白质和非编码基因的外显子转录和剪接。最初作为小鼠和人类细胞中普遍存在的分子被发现，这些 circRNA 随后在今天研究的所有真核生物中被发现为丰富、保守和稳定的物种

1. 引人注目的是，circRNA 通常是比 mRNA 更丰富的异构体。
2. 由于它们的共价闭合环结构，与线性对应物相比，circRNA 在细胞环境中具有更高的稳定性，这意味着 circRNA 的可能功能可能与这些分子的更长寿命有关。
3. 事实上，根据该领域的最新研究，已经提出 circRNA 可以充当 miRNA 和蛋白质海绵，参与基因表达和剪接的调节，并与疾病的发生和发展有关。因此，circRNA 也被认为是疾病预后和诊断的生物标志物，以及疾病治疗的靶点或工具

一、RNA合成和功能化

circRNA 制备的开始是合成具有合适的 5'-和 3'-末端功能的线性 RNA，用于末端连接。

• 对于酶促方案，这些功能通常是 5'-磷酸和 3'-OH。
• 然而，对于化学连接，所需的末端功能可能相当多样化（图。1）。因此，化学 RNA 合成允许在 5'-和/或 3'-末端特定位点引入所需的功能是一个有价值的选择。化学 RNA 合成仅限于约 50 至 70 个核苷酸长度的寡聚体。然而，RNA 片段的连接协议是可用的，可以在 RNA 环化协议中实施。例如，最近我们制备了一种修饰的 129mer RNA，用于通过 2 个 RNA 片段的酶促和化学连接进行荧光研究。作为化学合成的替代方法，RNA 可以通过体外转录产生，这允许制备几乎无限长度的 RNA，但是，需要合成后的功能化策略。

二、5'-3'-末端连接的环化策略

一般来说，由于与环化步骤相关的负熵（negative entropy），从线性前体制备 circRNA 非常具有挑战性。最重要的副反应是形成分子内键（intramolecular bond forming），导致线性前体低聚而不是环化。这可以通过巧妙地选择反应条件来抵消，特别是通过严格控制浓度范围。在线性前体浓度较低的情况下，分子内反应优于分子间反应，但其缺点是制备规模的 circRNA 变得相当具有挑战性。

1. 因此，用于预先定位要连接的 2 个末端的特殊协议至关重要 (图 2a）。
2. 最有利的情况是基于线性前体的固有二级结构的自模板效应 (图 2b) 根据具体的连接方案(ligation protocol)，连接接头(ligation junction)可以位于折叠核酸结构的双链区域（切口位点,ick site）或位于 2 个反应末端彼此相邻的单链区域（例如发夹环）。该策略还允许模板辅助的环化收敛方法：需要设计构成全长线性/环状核酸的 2 个或什至更多片段以所需方式相互作用，以在一个中实现多位点连接和环化 。
3. 预先定向 2 个反应末端的其他方式可以包括线性或发夹辅助寡核苷酸（图 2c，d）
4. 或与线性前体的 5'-和 3'-末端相互作用的线性寡核苷酸（夹板, splint），从而带来 它们以侧翼排列，因此用作模板辅助连接的夹板（图 2 e，f）。

因此，连接位点和显式策略的选择取决于要环化的 RNA 底物，此外 受酶连接与化学连接决定的影响。

三、酶促策略

有多种酶促连接 RNA 片段的方案可供使用，其中最常使用 3 种不同的多核苷酸连接酶

3.1 T4 DNA 连接酶 (T4 Dnl)

该酶需要 ATP 作为辅助因子，并支持在 DNA 或 RNA 的双链区域或什至杂合结构内的 5'-磷酸和 3'-羟基之间形成磷酸二酯键。非常重要的是，只有在完全不扭曲的互补性和连接处没有核苷酸缺失的情况下，酶才会催化 2 个末端的共价连接。夹板可用于在连接位点周围创建所需的双链区域（如图 2f）。T4 Dnl 辅助连接 2 个 RNA 片段由 Moore 和 Sharp 开创，也适用于 RNA 环化。使用 DNA 夹板是最有利的，因为反应后夹板可以用 DNAse 消化。然后可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳轻松地将环化的 RNA 产物与线性前体分离。对于分子间连接，已经表明夹板的长度会影响连接效率。然而，一般来说，不可能预测具有普遍有效性的最佳夹板长度。因此，对于每个单独的系统，需要定义特别关注温度、化学计量和夹板长度的反应条件，以实现有效的连接。

T4 RNA 连接酶 1 (T4 Rnl1)

• 在 ATP 作为辅因子存在的情况下，该酶支持单链核酸的连接，并接受 DNA 和 RNA 片段作为底物。
• T4 RNA 连接酶可用于将 RNA 连接到 RNA，前提是供体含有 5'-磷酸，受体含有 3'-OH
• 在设计实验和定义环化的连接点时，应考虑到连接酶对供体链和受体链的末端核苷酸有不同的偏好。对于受体链的 3'-末端核苷酸，这是 A > G ≥ C > U，对于供体链的 5'-末端核苷酸，pC > pU > pA > pG

T4 Rnl1 辅助 RNA 连接已被用于生产大量均质和纯的 circRNA。这些合成的一个关键要素是利用 RNA 内在二级结构来定位 5'-和 3'-末端以进行有效连接。

T4 RNA 连接酶 2 (T4 Rnl2)

该酶将 RNA 受体链（3'-OH 基团）与 RNA 或 DNA 供体链（5'-磷酸基团）连接，优先在有缺口的 dsRNA 底物中。它是 T4 Rnl1 的近亲，由 Ho 和 Shuman 于 2002 年首次描述。

总结

总之，通过酶连接进行 RNA 环化是一种有价值的选择。上述所有三种酶都是 ATP 依赖性的，并通过 3 个核苷酸转移步骤催化 RNA 末端与 5'-磷酸和 3'-OH 的连接：

1. 酶与 ATP 反应形成共价连接酶-AMP 中间体；
2. 中间体的 AMP 转移到 5'-磷酸化 RNA 末端，形成 5'-RNA-腺苷酸 (AppRNA)
3. AppRNA 被 3'-羟基攻击形成磷酸二酯键，从而释放 AMP。

连接可以以分子内方式进行，从而产生 circRNA。不能完全排除通过分子间连接形成副产物。然而，待连接的 RNA 的内在二级结构与连接位点的巧妙选择和辅助寡核苷酸的应用可能有助于分子内连接，从而有利于 RNA 环化。

四、化学策略

化学策略以分子间或分子内方式的核酸链的化学连接允许形成天然磷酸二酯键。然而，除此之外，化学家的工具箱还提供了大量强大的反应，可用于连接同一分子的 2 个适当功能化的片段或末端。尽管天然磷酸二酯键的形成在产生未修饰的键方面是有利的，因为它发生在天然生物分子中，但产率通常不能令人满意。相反，更有效的反应可以通过反应末端的特定功能化/活化来实现，但这会在连接/环化的分子中产生非自然的连接。

五、RNA环化的核酶

另一种核酶支持的环状 RNA 生产方法依赖于自发的 I 组内含子自剪接系统（图 4）。一种环状排列的 I 组内含子前体 RNA，由端对端融合的外显子组成，这些外显子中断半个内含子序列，自我剪接以产生环状 RNA。正如后来证明的那样，外源序列可以整合到这种置换的自剪接系统的外显子中，从而允许合成具有所需序列元件的 circRNA。基于置换内含子外显子 (PIE，permuted intron exon) 方法，已在体外和体内产生了多种长达 1130 nts 的环状 RNA，主要在大肠杆菌细胞中

参考资料

• In vitro circularization of RNA。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5680678/#:~:text=The%20in%20vitro%20transcribed%20linear,a%20circular%20RNA%20is%20formed.