【3.4.2.1】scRNA-seq和空间转录组
一、单细胞分析
scRNA-seq于2009年首次报道，当时的研究者在含有裂解缓冲液的EP管中分离了单个卵母细胞。单细胞测序对生物学新问题的解释，以及现有的实验室和计算方法以极快的速度发展，甚至最近几年综述都已经过时了。每种scRNA-seq方法都需要将实体组织进行分离，分离出单个细胞（使用不同的方法），以及标记上每个细胞的RNA，对RAN扩增后进行测序，所有的这些方法都来源于早期常规RNA-seq的方法。
机械裂解和胶原酶加DNAase的酶解会生成单细胞悬液，从而产生大量可用的细胞，但是这种产生是高度组织特异性的，比较依赖于经验，其过程也需要非常小心。一旦制备好了单细胞悬液，就可以通过各种方法分离单细胞（FIG 3a）；大多数的实验都是使用流式细胞仪来进行单细胞分选，这种方法是最容易，它可以将单个细胞直接分选到含有裂解液的微孔板中。对于更高通量的实验，现存有大量分离单细胞的专门仪器，这些仪器需要自己构建或购买。
单个细胞可以通过物理手段被捕获到微流控芯片中，或者是通过Poisson分布的原理被分配到加载到含有纳米孔(nanowell)的芯片中，随后这些单细胞被分离后就被液滴微流分离技术合并到含有试剂的液滴中（例如Drop-Seq与InDrop），或者是单细胞被原位标记上标签（例如单细胞混合索引RNA测序技术, single-cell combinatorial indexing RNA sequencing, sci-RNA-seq以及分离-混合-连接转录组测序技术，split- pool ligation- based transcriptome sequencing,SPLiT-seq）。
单细胞分离后，它们就被裂解，将RNA释放到溶解中用于cDNA合成，并将cDNA用于RNA-seq文库制备。在文库制备过程中，来源于每个细胞的RNA会通过PCR进行扩增。这种扩增就引入了PCR偏倚，但是UMIs可以用于校正这种偏倚。由于Poisson采样，一个细胞中只有10-20%的转录本会被逆转录，这就限制了转录本检测的灵敏度，以及各种方法产生的可用数据。
在湿实验之外，计算方法也在迅速发展，最近已经出现了关于scRNA-seq的实验设计指南。方法学的快速发展意味着scRNA-seq方法的技术已经快速过时了。然而Ziegenhain等人提供了scRNA-seq方法的详细概述，他着重强调了UMIs的在数据分析方面 的重要性，并报道了提到了的6种方法中哪一种最为灵敏。然而他们的研究范围并不包括现在被广泛使用的10X Geneomics方法。
Figure3-单细胞RNA-seq与空间RNA-seq的概念
Figure 3-单细胞RNA-seq与空间RNA-seq的概念。(a)单细胞RNA-seq(scRNA-seq)工作流程概述。scRNA-seq的第一步就是从样本中分离单个细胞（例如从解离的皮肤组织），分离单细胞的方式有多种，其中包括微移液管将细胞转移到单独的微管中，或者是使用流式细胞仪将单细胞分选到含有裂解液的96孔板或384孔板中，或者是将细胞捕获到微流控芯片中，或者是将细胞分布到纳米孔(nanowells)中，或者是使用含有试剂的液滴分离系统，或者是使用原位条形码技术。细胞进行逆转录以产生cDNA（通常使用UMIs来对这些cDNA进行标记），用于制备RNA-seq文库和测序。质控(QC)，差异基因表达(DGE)与2D可视化(t-distributed stochastic neighbour embedding, tSNE)以及无监督聚类在和网络分析来对scRNA-seq的数据进行分析，用于区分不同的细胞种群。这些技术通常会标明细胞数据，以及与RNA-seq的策略一样，还会标明测序技术是3’末端还是5’末端还是全长cDNA。(b)空间转录组学工作流程概述。空间编码需要将冷冻组织切片加到含有寡聚核苷酸微阵列的载玻片上，或者是加载到密集包装的被寡核苷酸包被的pucks上。mRNA扩散到载玻片表面，然后与oligo-dT合成引物杂交，这些引物中含有UMIs与空间编码序列。随后mRNA逆转录成cDNA，cDNA汇集起来用于文库制备和测序。空间转录本组学的计算方法以能够将测序读长回贴到它们的空间坐标上，随后是DGE分析与差异空间表达分析的可视化。scRNA-seq与空间RNA-seq数据通常是用短读长测序仪进行测序的。上述图片(a)源于Springer Nature Limited。
当研究者们在选择scRNA-seq方法，需要考虑的主要因素包括：他们是否需要全长转录本的读长，在分析更多细胞表达谱（宽度, breadth）或每个细胞更多转录本（深度，depth）之间进行权衡，以及总体实验成本。
全长scRNA-seq系统的通量比较低，因此每个细胞需要单独地处理，直到最终生成scRNA-seq文库。但是，此系统可以让研究者们研究可变剪接与等位基因特异性表达。非全长系统则会从转录本的3’或5’末端生成序列，但这就限制了异构体表达的分析，但是当细胞cDNA合成被混合后，细胞所加工的数量会比前一种高出2到3个数量级。单细胞测序宽度与细胞，组织或样本的数量有关，而深度则是与测序读长数目固定下，要分析的转录组有关。虽然实验中测序的细胞数量是由选择的方法决定的，但是这也允许一些灵活性，不过随着分析的细胞数目的增多，测序成本的增加，往往限制了转录组分析的深度。因此，可以使用宽度和深度两个维度来评估不同的scRNA-seq系统。单细胞测序典型的做法是基于孔板或微流控方法来捕获尽量少的细胞，但同时对每个细胞检测出更多的基因，而基于液滴的系统可以用于分析最大数目的细胞，它已经能从超过一百万个细胞中产生单独的数据集。
scRNA-seq的力量正在推动着大规模的细胞图谱项目，这些项目指在确定生物体或组织中完整的细胞类型。人类细胞地图集(Human Cell Atlas)与NIH大脑计划(NIH Brain Initiative)项目分别是为了对人体以及大脑中的所有细胞类型进行测序。人类细胞地图集的第1阶段目标是对3000万到1亿个细胞进行测序，并将随着技术的发展在广度和深度上进行增加。这个项目的最新成本包括发现了离子细胞，以及发现肾癌是在儿童和成年人中是由不同的细胞类型发展而来的。不过，scRNA-seq的研究者们应该意识到，这些技术可以用于几乎所有的生物。最近，对A. thaliana根细胞原生质的分析表明，即使是植物的坚韧细胞壁这种障碍也能被解决，能产生用于测序的单细胞。scRNA-seq正在迅速成为生物学家们工具包的标准配置，并有可能在10年后被广泛使用，就像今天的常规RNA-seq一样。
二、空间分辨RNA-seq法
当前的常规RNA-seq和scRNA-seq方法为研究者们提供了关于组织或细胞群体的高度详细的数据，但是没有捕获空间信息，就是会降低细胞环境与基因表达之间关系的分析能力。空间转录组学(spatialomics)的两种方法是：
- 空间编码(spatial encoding)与
- 原位转录组学(in situ transcriptomics)。
在RNA-seq文库制备过重中，空间编码方法能够记录其空间信息，或者是通过分离空间受限的细胞（例如，通过激光捕获显微解剖， laser-capture micro-dissection, LCM）， 或者是通过分离前的位置对RNA加上条形码（通过从组织切片中直接捕获mRNA）(FIG. 3b)。原位转录组学能够在组织切片中，通过对细胞中的RNA进行测序或成像来生成数据。我们建议感兴趣的读者是阅读最近的深度评论，从而对这一领域进行更全面的理解。
LCM已经成功地用于从组织切片中的特定区域分离和分析单个细胞用于RNA-seq。虽然LCM需要专门的设备，但是许多机构已经广泛使用了这种技术。但是，虽然这种技术可能实现高度空间分辨率，但是它消耗人力，并且难以批量使用。使用空间转录学 (Spatial Transcriptomics，10X Genomics)与Slide-seq方法可以直接从冰冻组织切片中直接捕获mRNAs，然后将这些mRNAs直接加载到寡核苷酸微阵列玻片(oligo- arrayed microarray slides)或严密包装寡核苷酸的pucks上。寡核苷酸包括空间条形码、UMI和oligo-dT引物，它们能唯一地识别每个转录本及其位置。测序读长被回贴到玻片的坐标上，用于生成空间基因表达信息。空间转录学方法已经被证明能够在一系列物种的组织中能发挥作用，其中就包括小鼠大脑和人类乳腺癌组织，人类心脏组织和拟南芥(A. thaliana)花序组织。Slide-seq是最近开发的一种技术，它已经被证明能够对小鼠大脑的冰冻切片进行测序。这些直接 mRNA捕获方法并不需要特殊的设备，且有相对简单的分析方法，并有可能大规模地应用于许多组织。然而，还有两个局限需要解决。
- 首先，该技术只能应用于新鲜的冷冻组织。
- 其次，分辨率受到到阵列大小和捕获寡核苷酸点和珠子的间距的限制；目前的分析只能使用6.5x7 mm和3x3mm这两种规格，这就限制了组织切片的尺寸。
空间转录组学斑点的直径为100μm，间距为100μm，这意味着它们不够小或不够密集，无法实现单细胞级分辨率。Slide- seq珠子则要小的多，直径只有10μm，而且非常密集，比相对前者具有十倍的空间分辨率，并且测序中的大约一半的珠子似乎是从单个细胞层面产生的数据。从分解的组织和空间编码的数据与scRNA-seq混合起来的计算方法可以改善分辨率，但是需要基础技术的进一步发展，以使其成为更常规的RNA-seq工具。
上述空间分辨RNA-seq方法的替代方案包括原位测序和使用单分子荧光原位杂交的基于成像的方法。这些方法能够产生比RNA-seq方法更窄的转录组信息，但它们能直接检测RNA，并且能够对低丰度的转录本进行分析。同时，它们还能提供组组织结构和微环境的信息，并能产生亚细胞数据。这种方法目前正取得了巨大进步，但是成像方法的一个主要局限就是需要高分辨率或超分辨率显微镜与自动流体技术结合，并且这种技术的成像时间可能要花上数小时，甚至是几天。测序成本的下降比摩尔定律预测的速度更快，与测序成本相比，高通量成规模的成像系统的机会似乎更有限。
上述提到的空间转录组学都受到无法产生深度转录组学数据的限制，以及受到细胞分辨率和/或高成本（时间和/或资金）的限制，但是这些方法正在迅速改进，并且已经应用于临床样本。空间转录组学的具体计算方法开始出现。此外，原位RNA测序和成像方法的进步已经使得10E3到10E5个细胞生成的转录组数据成为可能，这与基于液滴的单细胞方法获得的数据量相近。未来的发展有可能使得空间转录组学让更普通的研究者们使用。然而，大多数的研究们者并不太可能需要真正的单细胞或亚细胞级分辨率。因此，转录组表达谱的宽度和对广泛的组织或样本的应用性可能会推动这些技术在特定小众领域被采用。如果空间转录组学的这些技术限制能够被解决，那么它才有可能被广泛使用。
参考资料
