【6.2.1.3】N-end rule
The N-end rule states that the stability of a protein is largely determined by the presence of “destabilizing” or “stabilizing” N-terminal amino acids; the exact form of the rule is dependent on the physiological state of the cell (40). In mammalian reticulocytes, the primary destabilizing residues include Arg, Phe, and Ala, whereas Asp and Glu are secondary. Met, Val, and Gly are classified as stabilizing residues. In yeast, the N-end rule is essentially similar but not identical to that of mammalian reticulocytes: Ala, Ser, and Thr are stabilizing residues and Ile is a destablizing residue.
N 端规则将蛋白质的体内半衰期与其 N 端残基的身份联系起来。 N 端规则源于普遍存在的蛋白水解途径的活性，称为 N 端规则途径 （N-end rule pathway.）
一、蛋白质水解 Proteolysis
蛋白质水解或蛋白质降解（Proteolysis, or protein degradation,）是导致蛋白质中一个或多个肽键水解的一组过程。蛋白水解是蛋白质周转的一部分，其中特定蛋白质的分子首先通过核糖体介导的翻译产生，并最终以特定于相关蛋白质的方式和速率被破坏，并取决于生物体的状态。
细胞内蛋白质的体内半衰期从几秒到几天不等。细胞内蛋白水解的两个主要功能是选择性破坏受损或其他异常蛋白质，以及正常蛋白质的调节破坏，其浓度必须根据细胞状态而变化。
代谢不稳定性（体内半衰期短）是许多调节蛋白的特性。这些蛋白质的进化不仅是为了执行它们的主要功能，例如磷酸激酶或转录阻遏物的功能，而且还在体内被迅速破坏。调节剂的短半衰期提供了一种产生其空间梯度的方法，并允许通过其合成速率的变化快速调整其浓度。蛋白质也可以是条件不稳定的，即寿命长或寿命短，这取决于蛋白质所属的分子回路的状态。这一事实，以及与旧的、构象成熟的相同蛋白质分子相比，蛋白质新形成分子的破坏速度更快（通常）导致复杂的降解动力学，因此单个 特定蛋白质的寿命充其量是其体内实际衰减曲线的近似值（图 1）。
二、泛素系统 The Ubiquitin System
泛素 (Ub，ubiquitin) 系统，也称为 Ub-蛋白酶体系统（Ub-proteasome），是靶向并破坏特定细胞内蛋白质的一组主要途径。在真核生物中，N 端规则通路（图 2）是 Ub 系统的一种通路。 Ub 是一种高度保守的 76 个残基蛋白质，通过三种酶 E1、E2 和 E3 的作用与其他蛋白质（包括其他 Ub 分子）的赖氨酸残基的 ε-氨基结合。泛素化的选择性由 E3 决定，它识别底物降解信号（degron）。术语Ub ligase 表示 E2-E3 复合物或其 E3 组件。
泛素化蛋白质底物带有共价连接的多聚 Ub 链，它介导底物与 26S 蛋白酶体的结合，26S 蛋白酶体是一种 ATP 依赖性蛋白酶，可逐步破坏结合的蛋白质，产生短肽。特定蛋白质的降解速率是通过调节它们的 degron 的结构或空间暴露来调节的，也可以通过控制 Ub 连接酶的活性来调节。 Ub 系统的生理功能涵盖范围广泛：细胞分化、细胞周期、胚胎发生、细胞凋亡、信号转导、DNA 转录、复制、修复和重组、跨膜和囊泡转运、应激反应（包括免疫反应）、功能神经系统和许多其他过程。
N端规则途径中三级、二级和一级去稳定残基的氧化和酶促反应的化学表示。 三级去稳定残基可通过脱酰胺或氧化降解，形成改变的 N 端残基。 该二级去稳定残基通过精氨酰 tRNA 转移酶 (ATE) 添加 Arg 残基。 随后的主要去稳定残基是 N 端蛋白酶体目标。
三、N 端规则途径 N-End Rule Pathway
Ub 系统的多种蛋白水解途径的共同点是它们依赖于 Ub 结合和蛋白酶体，并且在很大程度上不同之处在于它们利用不同的 E2-E3 复合物。 N 端规则途径的 Ub 连接酶靶向带有特定（不稳定）N 端残基的蛋白质（图 2）。相应的 degron，称为 N-degron，由底物 去稳定 N 端残基和内部赖氨酸残基组成，后者是形成底物连接的多聚 Ub 链的位点。由于 N-degron 必须通过蛋白水解裂解产生，从而产生不稳定的 N 端残基，新生的 N 端规则底物包含一个神秘的 N-degron，称为 pro-N-degron。
在酵母酿酒酵母中，225-kDa Ub 连接酶 UBR1 的两个底物结合位点识别（结合）两种类型的主要不稳定 N 端残基：
- 碱性（1 型：Arg、Lys、His）
- 大量疏水性（类型 2：Phe、Trp、Leu、Tyr、Ile）（图 2B）。
- 其他几个 N 端残基作为三级 (Asn, Gln) 和二级 (Asp, Glu) 去稳定残基发挥作用，因为它们只有在酶促缀合到 Arg（一种主要去稳定残基）后才能被 UBR1 识别（图 2）。在 N 端 Asn 和 Gln 的情况下，Arg 的结合先于酶促脱酰胺，以产生 N 端 Asp 和 Glu。在动物中（但不是在诸如酿酒酵母等真菌中），N 端 Cys 是另一种三级去稳定残基，因为 Cys 的精氨酸化先于其氧化。 N-末端残基的这些共价修饰/缀合反应是 Ub 缀合到带有 N-末端 Asn、Gln、Asp、Glu或 Cys 的 N 端规则底物步骤所必需的(图 2A)。
N 端规则途径的 UBR1 Ub 连接酶包含另一个第三底物结合位点，可识别途径底物中的特定内部（非 N 端）降解子。迄今为止已鉴定的此类的唯一生理底物是酿酒酵母的 35-kDa 同源域转录阻遏物 CUP9。 CUP9 抑制的基因中有 PTR2，它编码二肽和三肽转运蛋白。 CUP9 是一种短寿命蛋白质，由 N 端规则途径通过 CUP9 的 C 端附近的内部 degron 靶向。具有不稳定 N 末端残基的二肽变构激活 UBR1，导致 CUP9 体内降解加速并由此诱导 PTR2 表达（图 3）。通过这种正反馈，酿酒酵母可以感知细胞外肽的存在，并通过加速它们的吸收来做出反应。因此，UBR1 的 1 型和 2 型位点不仅作为底物结合位点，而且作为营养传感器，使肽输入的适应性调节成为可能（图 3）。二肽激活的机制涉及 UBR1 中的构象转变，由二肽的结合诱导，暴露了 UBR1 先前无活性（空间上无法接近）的 CUP9 结合位点。 铁汉 09:10:18 酿酒酵母 N 端规则通路的另一个功能是维持染色体稳定性。 在中期转变中，ESP1 编码的蛋白酶（称为分离酶）会切割 SCC1，这是一种黏连蛋白复合物的亚基，可将复制染色体的姐妹染色单体结合在一起。 得到的 SCC1 的 33 kDa C 端片段带有 N 端 Arg，并通过 N 端规则途径迅速降解。 在 ubr1D 细胞（缺乏通路-b-@-Ys Ub 连接酶）中未能降解 SCC1 的这个片段会导致染色体丢失的频率大大增加，大概是因为 cohesin片段的保留干扰了 在随后的细胞周期中组装完整的粘连蛋白复合物。 因此，UBR1 Ub 连接酶的 1 型结合位点具有二肽结合营养传感器（图 3）和识别具有不稳定 N 端残基的蛋白质的位点的双重功能，针对这些蛋白质进行 Ub 依赖性降解。
甲硫氨酸氨肽酶 (MetAP) 是 N 端 Met 特异的蛋白酶（每个新生蛋白质都带有 N 端 Met），当且仅当 Met 之后的第二个残基是 N 端的稳定残基时，才会去除该 Met 残基-结束规则。 在哺乳动物 N 端规则中，唯一的例外是不稳定的残基 Cys、Ala、Ser 和 Thr（图 2A）。其他不稳定的残基只能通过除 MetAP 以外的蛋白酶的切割而暴露在蛋白质的 N 末端。 一种这样的蛋白酶是分离酶，如前所述，它切割粘连蛋白的 SCC1 亚基。一大类蛋白酶也可以在体内产生蛋白质 N 末端的不稳定残基，是去泛素化酶 (DUB)。这些蛋白酶催化的一种反应是在 Ub-X 连接处切割线性 Ub-X-多肽融合体；无论连接处的残基 X 的身份如何，这种共翻译切割都可以发生，脯氨酸是一个例外。一种称为 Ub 融合技术的方法利用了 DUB 的这一特性，使得在体内其他相同的测试蛋白的 N 末端产生不同的残基成为可能，并在 1986 年发现了 N -结束规则。
除了 CUP9 和 SCC1，还发现其他几种蛋白质是 N 端规则途径的底物。 这些蛋白质包括辛德毕斯病毒 RNA 聚合酶（和其他甲病毒的同源聚合酶）、人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的整合酶、细菌蛋白 p60，由单核细胞增生李斯特菌分泌到受感染哺乳动物细胞的细胞质中，哺乳动物 GTPase- 激活蛋白 (GAP) RGS4 和 RGS16、酿酒酵母 GPA1 编码的 Ga 蛋白和脑心肌炎 (EMC) 病毒 3C 蛋白酶。 这些蛋白质通过 N 端规则途径降解的生理功能（如果有的话）是未知的或尚未明确确定。
多细胞真核生物的 N 端规则通路的组织方式与酿酒酵母中的类似，但具有几个附加特征。
- 其中之一是存在至少三种功能重叠的 Ub 连接酶，它们靶向通路 底物，与单一的此类连接酶 UBR1 形成对比，在酿酒酵母中（图 2）。小鼠的分子遗传分析表明，通过删除编码精氨酸-tRNA-蛋白质转移酶（R-转移酶）的 ATE1，哺乳动物 N 端规则通路的精氨酸化分支（图 2A）对心血管发育至关重要.还发现哺乳动物 N 端规则通路对精母细胞的减数分裂至关重要：在缺乏 UBR2（通路Ub 连接酶之一）的情况下，精母细胞无法形成联会复合物并死亡，导致雄性 UBR2 2/2 小鼠不育。相应的分子电路以及生理 N 端规则底物，其代谢稳定导致这些突变体中的心血管和减数分裂表型。
- N端规则途径的另一个功能是调节黑腹果蝇的细胞凋亡（程序性细胞死亡）。具体而言，活化的半胱天冬酶（介导细胞凋亡的特定蛋白酶）切割细胞凋亡抑制剂 DIAP1，产生带有 Asn（N 端规则中的三级不稳定残基）的 DIAP1 的大 C 端片段（图 2A）。该片段通过 N 端规则途径的降解下调了果蝇的细胞凋亡，可能是通过同时破坏 DIAP1 相关的细胞凋亡激活剂。产生生理 N 端规则底物的蛋白酶组不太可能仅限于 MetAP、半胱天冬酶和分离酶。例如，称为钙蛋白酶的钙激活蛋白酶的切割特异性以及其他不太清楚的细胞溶质和/或核蛋白酶的特性表明，它们也可能作为 N 端规则途径的上游组分起作用。尽管 N 端规则通路的许多功能仍有待发现，但已经出现的 肽导入、染色体稳定性、心血管发育、减数分裂和凋亡 的功能惊人地多样化。因此，N 端规则通路的广泛功能范围在微观上类似于 Ub 系统的更大跨度。
参考资料
