【6.6.3】用于早期筛选单克隆抗体粘度的计算工具（SCM）

sam点评：

1. 代码没有开源，差评
2. SCM的核心思想还是基于暴露残基的负电荷容易导致抗体黏性，所以即使没有这个软件，MOE算一下negative patch，不香么？

高浓度抗体溶液通常表现出高粘度，这对抗体药物的开发，制造和给药提出了许多挑战。抗体序列是决定高浓度溶液高粘度的关键因素。因此，可以从序列中鉴定出高粘度抗体的基于序列或结构的工具将有效确保只有低粘度的抗体才能进入development 阶段。在这里，我们介绍了一种空间电荷图（SCM,spatial charge map）工具，该工具可以仅从其序列中准确识别高粘度抗体（使用同源性建模来确定3维结构）。 SCM工具已在3个不同的组织中得到了广泛的验证，并且已被证明可以正确地正确识别高粘性抗体。作为一种定量工具，SCM适用于高通量自动化分析，并且可以在抗体筛选或工程设计阶段有效选择低粘度抗体。

一、前言

单克隆抗体（mAbs）是最常见的生物药物分子类型之一，并且有望继续发现和开发用于治疗人类疾病的新型mAb。因为大多数基于mAb的疗法都需要肠胃外（静脉内或皮下）给药，所以通常需要高浓度的抗体溶液（> 100 mg / mL）才能以小剂量注射获得与治疗相关的mAb剂量。最终用户的便利性是针对慢性疾病的mAb治疗的关键要求。虽然开发高浓度液体制剂可以通过降低给药频率为患者提供这种便利，但高浓度通常会带来诸如聚集和溶液粘度的挑战。高粘性抗体难以通过皮下途径注射（尤其是在老年患者中），并且在制造和加工过程中难以操作。

在传统方法中，在配方开发过程中，对观察到的不希望的溶液特性（例如粘度）进行了mechanistic理解，并相应地设计或开发了配方控件以控制粘度。另外，具有高粘度的抗体分子不适合任何平台制剂或技术，并且可能需要定制制剂或容器，这增加了资源，成本和开发时间。解决高浓度液体制剂开发相关挑战的一种方法已被生物制药行业广泛接受，这是对有问题的候选药物进行早期鉴定，筛选和工程设计。但是，在早期发现阶段筛选和解决高浓度liabilities 是不切实际或无效的，因为资源和材料的可用性通常都受到限制。开发新的计算机模拟预测工具或高通量方法以筛选和减少或消除此类有问题的候选对象是成功进行可开发性研究的前提。尽管已经提出了一些有关造成高粘度的抗体特性的假设【1-5】，但目前尚无法做出有效的预测。因此，给定的抗体是否将表现出高粘度只能在以后的阶段凭经验确定。

可以在发现（discovery ）阶段早期识别高粘性抗体候选物的方法，在解决抗体粘度问题方面将非常有益。可以对鉴定出的抗体进行工程改造（在蛋白质序列水平上通过单点或多点突变，从而保留生物学活性）或从抗体组中消除抗体，从而仅将粘度较低的抗体移至development 阶段。 通常，在发现或优化阶段，少量的抗体会以低浓度产生。因此，在开发过程的早期阶段就无法通过实验确定治疗剂量下的粘度。代替实验技术，可以在发现和优化过程中以高通量方式有效地使用从其序列/结构识别高粘性抗体的计算方法。

在这项工作中，我们提出了一种新颖的，高通量的计算机模拟工具，称为空间电荷图（SCM），用于使用同源性建模从序列获得3D结构识别高粘度抗体。该工具基于对粘度起源​​的分子理解。 Sharma最近报道了一种基于静电的抗体粘度预测方法的预测能力。一种结合了基于静电的预测因子，基于可变片段（Fv）序列的方法。 他们的方法有4个拟合参数，根据3个参数计算粘度：1）疏水指数，2）配方pH的净电荷和 3）电荷对称性。

在此，我们以先前发布的基于静电的方法为基础，并开发了定量的粘度预测评分，因此适合自动化。与诺华（Novartis），辉瑞（Pfizer）和MedImmune合作，验证了该工具针对多种抗体的实验测得粘度的预测。

通常，在生理条件下抗体溶液的粘度是由分子间（即，抗体分子之间）的相互作用驱动的，尽管这些相互作用的详细性质尚不清楚。例如：

• 短程相互作用（short-range interactions ）（例如，由疏水缔合驱动）可以是抗体粘度的驱动力，
• 或者长程相互作用（例如，由静电缔合驱动）可以是抗体粘度的驱动力。
• 此外，粘度驱动相互作用可能取决于抗体溶液的浓度和其他因素，例如配方，温度和剪切速率。

但是，对于高浓度抗体溶液，已发表的研究表明静电相互作用在抗体粘度中的作用。例如，抗体在低离子强度条件下在其等电点（pI）值附近具有较高的粘度。此外，基于负电荷的描述符与高浓度溶液的粘度具有良好的相关性。

遵循这些有前途的报告，我们开发了一种基于现象学(phenomenological)，基于静电的模型，该模型是完全定量的，因此适合自动化和高通量分析，以鉴定高粘度抗体。 SCM工具使用抗体结构作为输入来量化抗体表面上的（负）静电斑块。在我们之前的工作中，我们展示了残基标准化疏水性的空间求和（针对每个残基的暴露表面积的分数标准化）的应用，以识别易于聚集的区域，并根据其聚集倾向对抗体进行排名。在这里，我们计算残留电荷的空间总和（仅适用于表面暴露的残留物），并证明该数量（称为SCM）可用于鉴定高粘度抗体。

SCM工具的输入是3维抗体结构。由于IgG1抗体之间的非Fv域结构高度相同，因此我们仅在Fv区进行SCM分析。通常，很少有抗体的Fv域的实验结构。因此，我们采用同源性建模技术从抗体序列获得Fv结构。使用Fv域的结构，我们计算每个原子的SCM值和Fv域的SCM分数，如下所示：

其中H是Heaviside函数，而|。|是绝对值函数。从实验或分子动力学模拟获得多个（即一个整体）Fv域结构时，SCM_atom，i将计算为这些多个结构上的平均值（请参阅支持信息）。

如上计算的SCM分数代表Fv域上裸露的负静电贴片的程度和大小（见图1）。已发表的研究报告说，Fv域上负片的存在与高抗体黏度相关，因此我们期望SCM评分的高值与高抗体黏度相关。由于SCM评分未包含用于测量粘度的条件（例如，赋形剂，缓冲液，温度）和实验设置，因此应将其视为表现出高粘度的内在倾向的一种度量。为了进行验证，应将抗体之间的SCM得分与在相似配方和温度条件下获得的粘度数据进行比较。此外，由于我们仅在Fv域上计算SCM分数，出于验证目的，我们比较了相似同种型抗体溶液的粘度。在这项研究中，我们专注于IgG1抗体，因为大多数实验粘度数据可用于该同种型，并且与IgG2抗体相反，该同种型不表现出结构异质性，而IgG2抗体由于铰链区二硫同工型而表现出结构异质

本论文中报道的IgG1抗体的实验粘度是通过各自的组织进行测量的；但是，在实验粘度测量过程中使用了不同的实验装置和不同的配方。由于方法和配方差异，这三个组织发现了一系列粘度值。因此，我们没有尝试将这些实验粘度与计算出的SCM分数进行直接比较，而是报告了3个单独的比较。我们将每个组织的实验粘度与计算出的SCM得分作图（图2、3、4）。 SCM分数高表明粘度高。因为在这些组织使用了不同的配制条件和实验设置，所以在这些图中的每一个中，用于区分低粘度和高粘度抗体（即，粘度大于约20 mPa-s的抗体）的SCM得分阈值都不同。例如，在诺华公司，大于〜1200的SCM得分是高粘度抗体的良好预测物，而在辉瑞公司，大于〜1600的SCM得分是高粘度抗体的良好预测物。

非Fv区域驱动的分子间相互作用也可能导致抗体的高粘度。 因此，可能需要除SCM分数（仅在此报告中仅在Fv区域上计算）以外的参数来进一步完善预测。 为了获得这些附加参数，需要附加的实验数据来区分非Fv区的作用（例如，区分CL在κ与λ轻链中的作用；请参见表1-3）。 基于Fv的SCM评分能够在典型的抗体发现-开发程序中快速，高通量和准确地鉴定高粘性抗体，在该程序中，候选抗体之间的大部分序列差异都限于Fv区。

总而言之，我们在这里提出一种称为SCM的现象学（phenomenological ）模型，用于对抗体Fv域上的负电势斑进行粗略定量。已发表的研究表明，Fv域上带负电的补丁在某些抗体溶液的高粘度中起作用。但是，静电势本身不适合直接的高通量分析。此外，静电势分析本身是很主观的，并且可能导致研究人员之间的差异。也不可能对结构整体上的静电势进行分析（通过分子动力学模拟生成），仅留下静态分析，这可能在很大程度上取决于所选的静态结构。

另一方面，SCM分数可量化Fv域表面上负电性贴片的程度和大小，从而克服了所有上述限制。 SCM评分已广泛交叉验证，可用于区分3个不同组织中的低粘度和高粘度抗体，并且已证明SCM评分高是高粘度抗体的准确预测指标。因此，可以在开发程序的早期应用SCM工具，以从抗体面板中识别可能具有高粘度的分子。这些抗体可以进行工程改造以降低其SCM评分（从而降低其粘度），也可以从抗体小组中删除。该策略可以有效地确保只有在高浓度溶液中显示低粘度的抗体才能进入开发阶段。

二、结构建模

2.1 诺华单克隆抗体

抗体Fv结构域的结构是从我们先前的研究中获得的。简而言之，使用WAM建模工具从序列中生成Fv结构域的结构。在少数情况下，链的C末端不是通过以上协议生成的；这些残基的坐标是使用Swiss PdbViewer程序的“添加残基”实用程序生成的。使用VMD的PSFGEN插件为每个结构生成了氢原子的坐标。此最终模型用于SCM计算。

2.2 辉瑞单克隆抗体

使用MOE中的抗体建模器，建立了7个辉瑞单克隆抗体Fv区的分子模型。对于每个单克隆抗体，为Fv区创建了最多625个基于同源性的中间模型（25个主链模型，每个主链模型25个侧链模型）。使用AMBER99力场和反应场隐式溶剂化模型，通过能量最小化，将中间体优化至0.01 kcal / mol /Å2的均方根梯度（RMSG）。内部电介质设置为4，外部电介质设置为80。使用10 Å和12 Å的截止距离筛选非键合相互作用。根据GB / VI分数对中间体进行排名，并选择最佳模型作为最终模型。最终模型中的VL和VH结构域的C末端通过酰胺化被中和。最终模型也通过Protonate3D重新质子化以模拟pH 5.8。然后通过能量最小化将最终模型重新优化为低于0.00001的RMSG。最终重新优化的模型用于SCM计算。

2.3 MedImmune mAbs

MedImmune抗体的Fv结构域结构是使用Accelrys的Discovery Studio软件中的“构建抗体Fab区域”工具生成的。 对于每个Fv结构域序列，选择了高分辨率且高度相同的轻链，重链和界面模板，并通过同源建模为抗体框架生成了20个中间模型。 通过模拟退火步骤优化了这些中间模型。 选择具有最低PDF（描述几何特征约束的概率密度函数）总能量的模型用于详细的互补决定区（CDR）环路建模。 在CDR环路建模期间选择了20个中间模型，并且通过分子动力学退火进一步优化了每个模型。 最低能量模型用于SCM计算。 铁汉 16:49:10

三、空间电荷图计算

使用该蛋白质的完全原子3维结构来计算SCM分布，如下所示：

在此，如果蛋白质结构中残基的侧链原子的溶剂可及区域的总和≥10 Å^2，则认为该残基是溶剂暴露的。 使用CHARMM22力场在配方pH下计算每个原子上的部分电荷。一旦获得每个Fv的SCM分布图，则Fv域的SCM得分计算如下：

其中H是Heaviside函数，而|。| 是绝对函数。

四、粘度测量

4.1 诺华单克隆抗体

在相同的配制缓冲液和pH（5.8）中制备的诺华单克隆抗体，N1-N5和利妥昔单抗的粘度数据已生成。将所有mAb浓缩至其表观溶解度极限，然后在制剂缓冲液中稀释至150 mg / ml。使用Malvern Kinexus Ultra粘度计在25°C下对所有mAb进行粘度测量，并通过计算的消光系数通过280 nm处的UV吸光度确定蛋白质浓度。在所有实验中，实验条件均保持相同。

4.2 辉瑞单克隆抗体

在相同的配方缓冲液和pH（5.8）中制备的7种辉瑞mAb上产生了粘度数据。将所有mAb浓缩至其表观溶解度极限，然后在制剂缓冲液中稀释至150 mg / ml。使用Anton Paar锥板粘度计在25°C下对所有mAb进行粘度测量，并使用SoloVPE仪器确定蛋白质浓度。在所有实验中，实验条件均保持相同。没有盐加入配方缓冲液中。

4.3 MedImmune mAbs

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参考资料

• MAbs. 2016 Jan; 8(1): 43–48.Computational tool for the early screening of monoclonal antibodies for their viscosities. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4966561/