【3.6.1】小型药物结合物对实体瘤的治疗(ADC)

药代动力学与药效关系非常复杂，肿瘤药物的渗透是影响疗效的关键参数之一。在经历了许多创新周期并见证了许多失败的抗体-药物偶联物（ADC）的背景下，许多替代技术正在解决此功能。基于免疫球蛋白的ADC继续在工业领域占据主导地位，但是较小的形式有望将更有效的细胞毒性有效载荷传递给实体肿瘤，并且通过更快的清除率提供更高的治疗窗口。为了使这些较小的格式能够用作送货工具，正在采用多种策略，此处将对其进行回顾。这些措施包括确定最合适的尺寸以产生更大的治疗窗口，增加通过缀合或半衰期延长技术或其他在不引起毒性的情况下延长剂量的方式递送的功能性细胞毒性有效载荷的量。格式化药物结合物

抗体-药物结合物(Antibody–drug conjugates)是临床和商业上公认的癌症治疗方法，最近两年已批准了五种新药。 治疗实体瘤仍然是许多失败的主要挑战，小型药物偶联物为肿瘤渗透问题提供了解决方案。

一、前言

多年来，已经深入讨论了药物渗透到实体瘤中作为影响疗效的因素，但是直到现在才被积极地解决[1]。 尤其是对于生物疗法，药物剂量与肿瘤吸收之间的关系非常复杂，而且通常情况下，整个肿瘤的微观分布与药物剂量或血浆浓度无关，这种未被充分认识的变异性可以解释由于浓度欠佳而导致的不良反应 肿瘤微环境（TME）中治疗药物的使用[1,2]。 单克隆抗体（MAb）尤其如此，单克隆抗体必须克服许多生物障碍[3,4]，例如血管供应不足，穿过内皮，克服肿瘤间质液压力，通过致密基质扩散并穿过紧密的上皮屏障（ 图。1）。 这通常导致人体实体瘤中靶标反应的MAb / ADC注射剂量/克的<1％[4-6]。

通过肿瘤脉管系统和渗透的药物偶联物递送可以用宽泛的三个PK曲线来说明。 （A）分子量> 150 kDa的常规ADC在数天内会累积并渗透到肿瘤中，并在数周内从体内清除掉，因此给药频率较低，但脱靶/累积毒性的风险较高。 （B）各种较小的（5–100 kDa）基于蛋白质的结合支架，例如scFv和DARPins，它们的吸收和渗透动力学持续数小时，但消除速度更快（数天），从而减少了非特异性暴露时间 ，但可能需要更高的药物投放策略（例如，更高的DAR，HLE，更频繁或更高剂量）。 （C）非常小的肽结合物（<5 ka），具有非常快速，更完整的摄取和渗透动力学，但在数小时内被消除，还需要采取策略来改善时间暴露。

这些越来越多的临床前和临床数据支持的观察结果促使研究人员寻找较小形式的靶向治疗药物，由于较快的扩散动力学，已知这些药物与大分子蛋白（例如免疫球蛋白）相比具有更好的组织穿透（灌注）特性。 [7]。当然，较低分子量（MW）的疗法在积极方面带来了一系列全新问题（例如，由于与Fc受体的交叉反应减少而引起的副作用减少，对正常组织的时间暴露减少，肿瘤更高：血浆暴露率）和消极面（较小的生物利用度窗口，降低了总体摄取）[8,9]，因此，取得平衡以取得有利的窗口是关键，而且可能比抗体药物偶联物（ADC）领域更重要[3,10]。

九个批准的产品和在临床试验中接近100个ADC [10,11]，在经历了无数次挫折和创新周期之后，这种模式再次呈上升趋势。由于上述原因，有效治疗实体瘤仍然是一项重大挑战，在血液学癌症中取得了更大的临床成功[11,12]。 ADC行业坚定地专注于免疫球蛋白形式，提供了多种方法以实现精巧的缀合和更均一的产品质量，但不断发展的领域是使用更小的形式（即小于150 kDa的抗体片段或结合支架），这有望扩大通过改善肿瘤杀死功效，同时降低正常器官毒性来达到治疗窗口。这篇综述将聚焦于从〜2 kDa肽-药物缀合物到更大的〜80 kDa免疫球蛋白片段衍生物的新兴小形式“生物制剂”，它们都将具有非常不同的药代动力学（PK）和药代动力学特性（图1）。对于较小的形式，化学连接物-有效负载对这些性质的影响更大，因为它可占总缀合物质量的10％至30％，而IgG的典型比例为2-3％，因此需要特别考虑和定制设计（图2；表1）。这篇综述将集中在非放射性和非脂质体药物结合物上。

各种药物偶联物的大小和形式比较。 原型IgG具有常见的偶联策略（A）表面赖氨酸，（B）铰链硫醇，（C）位点特异性硫醇，（D）Fc碳水化合物，（E）基因工程标签或非天然氨基酸。 相同的颜色编码用于与尺寸减小的另一种较小的形式缀合：二价抗体片段（〜75–80 kDa），Fab或双抗体（〜50 kDa），高DAR ScFv（25 kDa），VH- 域（12.5–25 kDa），多种类型的支架（10–25 kDa）和各种肽。

二、重组抗体片段

重组抗体片段可用于多种工程方法[13,14]，以促进接头-有效负载生物结合，例如引入结合友好的硫醇。它们通常在原核系统中产生，从而消除了ADC领域中某些人使用的聚糖结合选项。与Fab片段相比，在发现过程中受到严格的选择压力时，诸如单链Fvs（scFv）和单域抗体之类的片段往往更健壮和稳定[14]。药物：抗体比率（DAR，drug:antibody ratio）为〜2时得到的抗体片段药物偶联物（FDC）具有与DAR4的标准ADC相比按质量计载有更多有效负载的特征，但半衰期较短，因此比ADC更低生物利用度。

Fab片段已被诸如scFvs之类的格式所取代，但存在证明原理证明的缀合物实例。早期偶联物具有中等效力，经过化学疗法批准的有效载荷，例如紫杉醇和阿霉素，在很大程度上无效，但是体外效价为200–500 pM的曲妥珠单抗–单甲基澳瑞他汀E（MMAE）FDC DAR1需要隔日给药，剂量为20 mg /公斤见任何肿瘤消退[15]。最近，在抗CD-20 Fab上附加了用于酶促缀合MMAE有效载荷的分选酶缀合标签的抗CD-20 Fab，也看到了这种高剂量要求[16]。与等效ADC的完全治愈相比，FDC必须每3天以20 mg / kg的剂量四次服用，以获得4/6的治愈率。值得注意的是，通过曲线下的PK面积测量，FDC的血浆暴露降低了约6倍。但是，FDC的容忍度更高。相似但双接头有效载荷（DAR3，可裂解和不可裂解的澳瑞他汀）也很有效（IC50为0.7–0.9 nM），但未在体内进行评估[17]。最近描述了基于曲妥珠单抗基于Fab的曲妥珠单抗（PBD）有效载荷类别（IC50在低pM范围内）的缀合物，其中先前应用于ADC的新型双马来酰亚胺二硫化物再杂交技术被应用于Fab中的天然半胱氨酸[ 18]。 tesirine有效载荷已用于多个临床阶段的ADC，但也是在停产的Rova-T和随后的其他产品中引起不可接受的毒性的原因[19]。用对称的双马来酰亚胺桥将其改性为更亲水。对于表达高人表皮生长因子受体2（HER2）的细胞，体外效价为6–7 pM，尽管亲和力降低且内在动力学可能降低（未确定），但其效力与基于曲妥珠单抗的ADC一样强。尚未探索体内功效[18]。

ScFvs是人工束缚的重组抗体结构，但代表了大多数使用展示技术的抗体发现程序的首选格式[13,14]。在需要时间紧迫消除的特定应用中（例如，在第二步之前快速清除），它们已被证明是有用的。有许多关于靶向光动力疗法的报道，其中有条件的细胞毒性光敏剂有效载荷被递送至肿瘤，但在激光照射之前必须从体循环中清除[20]。我们和其他人已经开发了这项技术，并证明了体内消灭肿瘤的副作用非常少[21,22]，但是这种两步疗法的复杂性阻碍了其商业发展。这并没有阻止一些公司将光学有效载荷和传统ADC结合在一起，从而可以采用治疗学方法同时对治疗剂进行成像并用于治疗[23]。

后来，我们将针对scFv的光动力疗法的工作扩展到了具有更大商业成功的常规有效载荷，并广泛称其为“ FDC”。使用特定的scFv VH–VL框架易发生化学偶联和高有效载荷负载，通过赖氨酸偶联可获得5–10的DAR，同时保留了关键的生物物理特性[24,25]。尽管本质上是异构的，但随机高DAR FDC的排列比赖氨酸共轭ADC少。不出所料，连接子-有效负载结构对生物物理特性（例如聚集，结合亲和力和热稳定性）产生了重大影响，导致我们专门定制有效负载以匹配scFv格式。与使用ADC的肿瘤相比，已观察到优异的肿瘤渗透性，并且在体外使用auristatin和美登素有效载荷观察到nM–pM效力[24-27]。开发基于DAR scFv的高FDC时的一个关键发现是，尽管理论上MW在肾脏排泄范围内，但连接子有效载荷的化学-物理性质却成为主要特征，从而将PK改变为主要的肝清除途径，并且一种比白蛋白结合半衰期延长（HLE）方法更慢的系统清除方法[26,27]。反过来，这使得FDC成为可行的选择，现在的剂量接近ADC的剂量

我们已经使用赖氨酸残基实现了较高的DAR，但使用C端半胱氨酸硫醇或专用的共轭标签可以获得较低的DAR，可以实现位点特异性共轭，与常规ADC领域的对齐更加紧密[10]。 SNAP技术就是一个例子，该技术利用一种经过改造的小型DNA-烷基转移酶作为识别和缀合结构域来连接苄基鸟嘌呤修饰的有效负载。使用衍生自临床批准的panitumumab MAb的scFv在体外观察到了针对表皮生长因子受体（EGFR）表达细胞系的低nM效能[28]。

Yap等人特别关注TME。 [29]开发了一种基于scFv的针对完整蛋白糖蛋白（GPIIb / IIIa：CD41 / CD61）的FDC，该蛋白在活性血小板上具有高亲和力构象，并且越来越多地被认为参与介导肿瘤的生长和转移。在TME中。使用分选酶识别标签，将具有Gly3接头的缬氨酸-瓜氨酸（vc）-MMAE与DAR1偶联。在体内，四剂6 mg / kg scFv-GGG-vc-MMAE产生了约〜8天的中度肿瘤生长延迟，证明了这种新方法的概念验证。使用Cy5双标记结合物进一步说明了靶向TME [29]。 Wang等人描述了使用scFvs的一个有趣的转折。 [30]旨在利用在ras驱动的癌症（例如胰腺癌）中看到的宏胞饮增多症。抗EGFR scFv重组融合到人血清白蛋白的III结构域（用于HLE）和载脂蛋白/载体，用于细胞毒性抗生素利达霉素。尽管未显示明确的特异性，但〜60 kDa的缀合物有效地内在化，并且在四种胰腺癌细胞系中均具有很高的效力（IC50范围为15–70 pM）。证实了通过非弹性蛋白途径递送ADC的概念，并给出了两次耐受性良好的，中等的肿瘤生长延迟（0.4 mg / kg）[28]。没有使用更高的剂量。模块化设计思想被用来构建具有磁共振成像（MRI）造影剂的纳米体-药物共轭物[30]。双对位抗EGFR纳米抗体融合到结合域（成像）和C3标签，以进行有效负载偶联。还通过抗白蛋白纳米抗体掺入了HLE。将一种由马来酰亚胺官能化的顺铂化疗药物偶联到融合蛋白的C末端，并通过透析非共价掺入Gd3 +。已证明摄取和成像，但对于相对中等效力的药物（IC50〜1 mM）并不意外。在体外仅观察到中等效力。在体内，结合物与游离顺铂一样有效（就铂含量而言），但耐受性要好得多。这是由于肿瘤中4-5倍的高积累，而T1加权MRI对比图像进一步支持了这一点[31]。

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三、讨论

抗体-药物结合物是需要开发的复杂疗法，这些挑战仍然存在于制造中。如此处讨论的，由于细菌生产提供了更容易的化学生产控制过程，非IgG格式提供了降低生产成本的可能性，产量更高，缺乏糖基化，并且由于体积更小而分析也普遍简化。这些功能是否会带来经济利益或患者利益，还有待观察。

精准医学通常是一个流行词，通常被用来形容针对患者的遗传特征量身定制药物疗法，但在其他患者特征方面，正越来越多地被使用。改善肿瘤渗透性的个性化给药方案可能是关键因素之一[1]，并且具有使肿瘤渗透性最大化的可用格式将增加临床实力。临床前对有效载荷成像技术（如基质辅助激光解吸电离质谱成像[72]）的使用越来越多，这可能在临床前动物模型水平上提供了信息。其他有助于渗透的策略，例如添加调节剂以增强渗透性（例如RGD（精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸）肽，增加血管通透性的内皮/上皮细胞的配体，例如NRP-1，富含Lys / Arg的肽[73]或TEM8靶向实体瘤中的基质[74]或LRRC15，与癌症相关的成纤维细胞标记[75]）将需要了解其他受体，从而使剪裁更加复杂。

正常组织中非靶向沉积引起的间接暴露被认为是ADC有效载荷毒性的关键驱动力[76,77]，这是由Fc介导的与血小板结合引起的曲妥珠单抗-丹参碱剂量限制性毒性的典型例子（血小板减少症[78]。由于消除了Fc受体的结合并减少了长期暴露，大多数这些小形式药物结合物有望克服这一问题，但是鉴于形式的广泛差异，改善的耐受性和结合物大小之间的明确相关性将难以证明。

肿瘤球体技术变得越来越容易获得，并在发现工作流程中得到使用，评估渗透率可以帮助确定候选者的优先级。我们和其他人发现，体外细胞杀伤能力（IC50）不能很好地指示肿瘤治愈的效果，因为不一定最强的结合物就能成为最佳的体内候选物[33]。 Shah等人[79]对体外IC50和体内ID50之间的相关关系进行了建模，结果表明，与细胞培养基相比，血浆中需要27倍的ADC才能达到肿瘤生长“停滞”的目的。这表明，在这些模型中，仍然存在实体瘤治疗的转移障碍，而较小的模型可以真正解决某些难以治疗的实体瘤所需的差异。

参考资料

• 2020, Tackling solid tumour therapy with small-format drug conjugates . https://academic.oup.com/abt/article/3/4/237/6004960