【6.1.2.2】肿瘤小鼠模型

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近日，国家癌症中心发布了最新的中国癌症报告。本次报告发布数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2016年登记资料，覆盖人口达3.8亿。报告显示，2016年全年我国新增癌症病例约406.4万例，新增癌症死亡241.35万例；从癌种发病角度看，肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和女性乳腺癌是我国主要的5种恶性肿瘤，占新发病例总数的57.4%；肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和食道癌是死亡率排名前5的恶性肿瘤，占死亡总数的69.3%。值得注意的是，不论是发病还是死亡，肺癌均占首位[1]。

图1.最新中国癌症发病及死亡情况

虽然人类的科技水平日新月异，但恶性肿瘤的发生率与死亡率依然居高不下，可以毫不夸张的说，抗肿瘤是一场旷日持久没有硝烟的战争。从化疗到靶向治疗，再到免疫治疗，科学家们想尽一切办法来战胜肿瘤，而无论哪一种方法，都离不开一样秘密武器——小鼠肿瘤模型。

FDA、NMPA及其他监管机构要求：在药物进入临床前必须在动物体内证明其有效性和安全性。对于一个完整的动物而言，无论是鼠、犬、猴，甚至人类，都是一个相互交织、互相作用的复杂生物系统。目前，没有体外筛选方法或是组合方法能够模拟和反映整个有机体的复杂性。因此，利用动物模型来评价候选药物对人体及疾病的影响是不可或缺的。

一、小鼠肿瘤模型的诞生

1915年一战期间，日本病理学家Katsusaburo Yamagiwa和他的助理Koichi Ichikawa正在努力研究一个致命武器，这个来自东京大学的二人组花了150多天把煤焦油涂在兔子的耳朵上，最后，他们发现兔子罹患了肿瘤。不管动机如何，Yamagiwa的兔子模型目前通常被认为是首例用于癌症研究的动物模型。不久后，美国加利福尼亚大学旧金山分校的肿瘤生物学家Melissa Reeves等人采用相似方法，在小鼠皮肤局部涂抹名为DMBA和TPA的已知致癌物，诱导小鼠发生了皮肤癌[2]。这是有记录的为人类抗癌事业牺牲的第一批小鼠！

加利福尼亚大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的肿瘤生物学家Melissa Reeves等人采用这种方法，在小鼠皮肤局部涂抹名为DMBA和TPA的已知致癌物，诱导小鼠发生皮肤癌，进而研究肿瘤如何从原发部位转移至继发部位。她的研究结果表明，皮肤癌不会按顺序从一个位置迁移到另一个位置——例如，从皮肤到淋巴结再到肺，而是“通过平行传播，同时进入淋巴结和肺部”[2]。

化学致癌物质可能会在数百个位点破坏DNA，而这种模型模拟了由广泛基因损伤引起的肿瘤的自然演变，这对于模拟因重复暴露于特定环境（如持续紫外照射）的人类肿瘤具有非常重要的借鉴意义，但该类模型费时较长，肿瘤的连续监测困难，高异质性可能会造成数据的处理难度增加，缺乏明确的基因操作等[2]。

现在距第一个动物肿瘤模型诞生已过去100多年，海量的小鼠肿瘤模型被开发出来，我们往往困扰于这样的问题，这些小鼠肿瘤模型到底是怎么构建的？每种模型的特点是什么？最优秀的模型又属哪一个？我该选什么模型？其实吧，每种模型都有其优劣，没有哪种模型能为我们解答所有问题， 因此，了解各类模型的特点，选择适合自己研究的模型，就变得尤为重要。以下，小编就几类使用比较普遍的小鼠肿瘤模型进行简单介绍。

二、小鼠肿瘤模型的选择

小鼠肿瘤模型大致可分为自发性肿瘤小鼠模型、诱发性肿瘤小鼠模型、基因修饰小鼠肿瘤模型、异种移植瘤模型（PDX或CDX）、同种移植型小鼠肿瘤模型（CDA或MDA)等。在选择合适的模型之前，首先考虑自己的实验目的是什么，不同的模型对应不同的试验目的。例如：

  • 肿瘤发生发展机制研究：诱发性肿瘤小鼠模型、基因修饰小鼠肿瘤模型等
  • 靶点在肿瘤上的抗肿瘤药物筛选和药效评价：PDX模型、CDX模型等
  • 肿瘤免疫治疗研究：CDA模型、MDA模型或经过免疫重建的PDX/CDX模型等

2.1 自发性肿瘤小鼠模型

正常的小鼠在大约一年半的生命周期里也有可能罹患癌症，不同品系的小鼠自发肿瘤的几率和类型不同，体现出遗传因素与癌症易感性的关联。

  • 优点：肿瘤的发生、发展与人类相似
  • 缺点：肿瘤的发生参差不齐，周期长，实验耗费大
  • 应用：研究遗传因素与肿瘤发生的关系等

应用示例：分离小鼠自发肿瘤细胞系

研究者从小鼠自发肿瘤建立起很多可在体外培养传代的肿瘤细胞系，如结肠癌细胞 CT26-WT、黑色素瘤细胞 B16，肝细胞癌细胞 H22，淋巴瘤细胞A20 等，这些肿瘤细胞系不仅为癌细胞的体外生物学研究提供了工具，而且可以移植到遗传背景相同、不会发生免疫排斥的其它小鼠体内，建立移植瘤小鼠模型。

常用小鼠肿瘤细胞系及其遗传背景

2.2 诱发性肿瘤小鼠模型

诱发性小鼠肿瘤模型是指利用化学致癌物诱发的实验性小鼠肿瘤模型。实验室常用的诱导化合物包括MNU（甲基亚硝基脲）、DEN（二乙基亚硝胺）等，可诱导小鼠发生肝癌、胃癌等多种肿瘤，为研究癌症的发生机理及肿瘤预防等提供了有用模型。

  • 优点：诱发因素和条件可人为控制，诱发率相对较高（指高于自然发病率）
  • 缺点：诱导时间较长，动物死亡率比较高，肿瘤出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表型不均一
  • 应用：验证可疑致癌因素的作用以及肿瘤预防研究

模型示例：DEN诱导原发性肝癌模型

DEN（二乙基亚硝胺）对人体和动物都具有剧毒，小剂量注射或经口给药就会造成严重的肝损伤，幼鼠腹腔注射后约6个月可建立原发性肝癌模型，是研究肝癌发病机制和过程的理想模型之一。

2.3 基因修饰小鼠肿瘤模型

研究发现某基因的过表达，缺失或突变会导致小鼠易发肿瘤，因此可以利用基因工程手段，引入致癌基因或敲除抑癌基因建立自发肿瘤或诱导生成肿瘤的基因工程小鼠模型，再在模型小鼠的基础上进行相应的实验。

  • 优点：适于研究基因和肿瘤的关系，在研究肿瘤发生发展的遗传原因，肿瘤免疫逃避的机理方面具有巨大的优势
  • 缺点：模型建立过程较长，费用较高
  • 应用：研究肿瘤的发病机制，例如环境因素与遗传背景是如何相互作用诱发肿瘤的；人为引入基因突变，为肿瘤标志物的确认，肿瘤的诊断以及治疗都提供了理想的模型

模型示例1：抑癌基因条件性敲除模型

人体重要的抑癌基因纯合敲除后往往胚胎致死，如P53、PTEN等，因此构建关键抑癌基因的条件性敲除小鼠，与组织器官特异性表达的Cre工具鼠交配可诱发不同肿瘤，详见下表：

模型示例2：癌基因点突变（或条件性点突变）肿瘤模型

某些关键基因虽然仅仅只有1个碱基发生了突变，但由于突变在关键位置，改变了蛋白的重要结构域，破坏了蛋白原有的功能，也会诱发癌症，如：

  • Kras-LSL-G12D：野生型Kras激活/失活效应是受控的，而突变型Kras蛋白功能异常，持续处于激活状态，导致肿瘤细胞的持续增殖。目前国际上应用最广泛的肺癌动物模型就是Kras-LSL-G12D小鼠模型，可以通过与肺上皮细胞特异性的Cre转基因小鼠杂交来实现K-ras突变体的激活，从而导致肺癌的发生[3]。

  • Apc-L850X：Apc基因是Wnt途径中重要的抑癌基因，对结直肠癌肿瘤的发生发展起到重要作用。Apc-L850X小鼠是通过ENU诱变筛选出来的一个小鼠品系，其Apc基因编码亮氨酸的第850号密码子(TTG)转变成终止密码子(TAG)，从而提前截断蛋白，Apc失去抑癌作用[4]。

  • Braf-Flox-V600E：Braf是下游MARK信号通路最强的激活剂之一，Braf在毛细胞白血病中突变率达90%以上,另外还在多种肿瘤组织中发现BRAF V600E突变,如恶性黑色素瘤、甲状腺乳头状癌、结直肠癌等。

模型示例3：癌基因条件性过表达小鼠模型

在小鼠上条件性过表达癌基因（包括激活型突变的癌基因）可以诱发肿瘤，如果同时过表达EGFP、tdTomato等元件，还可以进行活体成像研究，南模生物自主构建了多种基因过表达肿瘤模型，详见下表：

除上述常见基因修饰肿瘤模型外，南模生物还自主构建了肺癌、肝癌、胃癌等多种不同肿瘤的敲除、条件性敲除、点突变模型，详情可在公众号咨询我们。

2.4 病人来源异种移植肿瘤模型（PDX)

病人来源异种移植肿瘤模型（patient-derived xenograft model, PDX）是通过将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型。

  • 优点：保存了病人肿瘤组织的基因型和表型的多样性，比较真实的反映原始肿瘤的特性，更准确地反映病人肿瘤的发生发展机制；保存了肿瘤的基质细胞，保存了肿瘤的微环境，能更好地反映肿瘤病人的药物敏感性和耐受性。
  • 缺点：原始肿瘤的主要来源是为手术切除，建模难度高且不能反复获取。此外其构建时间长且成功率不稳定，随着传代次数增加肿瘤微环境也会逐渐被小鼠细胞外基质取代，因此传代次数有一定限制。
  • 应用：新药研发的临床前肿瘤学模型。

模型示例：肝癌PDX

PDX成功从各方面复制病人肿瘤的异质性，包括其分子层面，基因层面和组织层面上的复杂性，能够在不同的临床背景下为药物疗效及分析作出快速测试。

肝癌PDX不同药物配伍治疗后肿瘤生长曲线

2.5 细胞系来源的异种移植肿瘤模型(CDX)

细胞系来源的异种移植肿瘤模型(Cell line-derived xenograft model, CDX)是将体外培养的人源肿瘤细胞系移植到免疫缺陷小鼠体内而构建的肿瘤模型。基于细胞系的肿瘤模型作为经典的体内实验方法，在肿瘤学研究和抗肿瘤药物研发过程中有着极大的需求。

CDX模式图

  • 优点：动物个体成瘤差异较小，成瘤率高，具有建模时间短，重复性好，成本低等特点。
  • 缺点：接种的肿瘤通常来源于体外培养的同质性癌细胞，缺乏人源肿瘤生长的微环境。(使用重度免疫缺陷小鼠M-NSG等，可以避免上述缺点，让很多难以成瘤的细胞系在小鼠上顺利生长)
  • 应用：研究肿瘤的发展以及对于药物治疗的反应。

模型示例1：肝癌模型-HepG2皮下接种

实验室中常用的移植型肝癌模型根据其移植瘤所在部位可以分为原位型和异位型。异位型常通过在实验动物的皮下注射肝癌细胞形成肿瘤。皮下成瘤实验操作简单，成功率高，且肿瘤体积变化易于测量，方便给予局部干预。

HepG2皮下成瘤的组织学分析。正常的小鼠肝脏组织细胞（左）呈放射状排列，细胞轮廓清晰，胞核圆形居中，肝小叶结构清晰，组织结构形态正常；HepG2 皮下接种4周后形成的肿瘤组织中，细胞排列无序，胞核不清，可见空泡样变性结构，肝小叶结构消失组织结构呈不规则细胞团，符合肿瘤组织结构特征。

模型示例2：活体成像CDX肿瘤模型

带有Luciferase荧光标记的肿瘤细胞系可用于构建各类皮下，原位或转移型的CDX肿瘤模型。Luciferase报告基因系统以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性，其优点是可以在小鼠存活的情况下反复测量，分析不同时间点的荧光变化，以此来示踪肿瘤细胞的增殖与转移，数据结果更加真实可信。另外，活体成像技术对于肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质的使用，非常安全。

基于人结肠癌细胞系的颅内转移瘤模型。向裸鼠颈动脉注射不同接种量的，带有Luciferase荧光标记的人结肠癌细胞，并选取多个时间点通过活体成像术检测Luciferase在颅内的表达水平。

2.6 同种移植型小鼠肿瘤模型

PDX和CDX模型统称为异种移植瘤模型，与之对应，自然就有同种移植型小鼠肿瘤模型。同种移植型小鼠肿瘤模型又可分为CDA模型（Cell line-derived allograft models，将小鼠来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠）和MDA模型(Mouse-derived allograft models，将小鼠来源的肿瘤组织接种至免疫健全的近交系小鼠)两类。同种移植型小鼠模型免疫系统健全，可用于研究肿瘤的免疫治疗，常用于目标靶点在免疫系统上的研究中。

同种移植型小鼠肿瘤模型构建

2.7 免疫检查点人源化模型

有的小伙伴就要问了，那我想要在免疫系统健全的小鼠上研究人源的靶点，例如PD-1、CTLA-4等近几年大火的免疫检查点怎么办？别急，这只需要在免疫系统健全的小鼠上对相应的免疫检查点进行人源化替换即可！南模生物目前拥有400多种人源化小鼠品系（包括双靶标、三靶标、四靶标人源化小鼠），模型资源库涵盖目前最新最热的免疫治疗靶点，成品人源化小鼠目录如下：

三、小鼠肿瘤模型优缺点比较

看完今天的介绍，相信大家对小鼠肿瘤模型已经有了一个整体的了解，我们在真正选择小鼠肿瘤模型时需要根据自己的实验设计，考虑各种模型的优缺点，这里小编也将各个模型按照类似性、重复性、可靠性作一个评价，详见下表。最后，祝大家都能找到合适的肿瘤模型，实验一帆风顺!

下面的内容很混乱，就不用玩下看了。后续再来整理！！！！！

基因工程小鼠模型（GEMM）

顾名思义，GEMM（Genetically engineered mouse model）是通过对小鼠基因进行改造而构建的肿瘤模型，改造手段包括转座子技术，基于同源重组（或非同源末端连接）的胚胎干细胞和CRISPR-Cas9技术等。

如敲除小鼠抑癌基因p53，其罹患肿瘤的概率也会随之增加，并且这些自发肿瘤完全保留了其异质性，可以更好地模拟人类癌症特征，但另一方面，这类基因敲除通常会诱发多系统肿瘤，自发成瘤周期也因小鼠个体差异难以保持同步， 并且GEM通常只包含一两个基因改变，而人类肿瘤一般有多个基因突变等….

说到这，问题来了，既然以上所言的小鼠模型不甚如人意，那么现在研究者们普遍使用的肿瘤模型又有哪些呢? 主要有以下几种：

肿瘤动物模型的分类:

1. 小鼠同种移植肿瘤模型 (同系移植小鼠模型)

Transplantable mouse cancers. Strategies for developing immune checkpoint blockers (ICBs) (part a). In the standard transplantable model, histocompatible cancer cell lines are injected into immunocompetent inbred mice(usually subcutaneously into the flank). After a few days, developing tumours are palpable and experimental immunotherapy with ICBs can commence (for example, every 3 days for 15 days) with regular monitoring of tumour growth. Tumour-infiltrating lymphocyte (TIL) populations may be studied from harvested tumours at the end of the observation period (for example, to investigate treatment-related immune effects).[3]

同系移植小鼠模型（syngeneic model）是将组织相容性的肿瘤细胞系，即同种背景来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠（通常为C57BL/6 or BALB/c strains）体内，接种部位常为皮下（方便直接观察肿瘤的生长情况），原位（模拟肿瘤生长的源环境），系统注射（腹腔或静脉注射，监测肿瘤的扩散情况），如上图。

该模型操作简单，成本低，可重复，肿瘤生长迅速且趋于同步，但接种的肿瘤通常来源于体外培养的同质性癌细胞，并且缺乏人源肿瘤生长的微环境。

小鼠肿瘤毕竟产自小鼠，既然我们的最终目的是“以人为本”，那直接进行人源肿瘤移植岂不更佳？至于免疫排斥嘛， 人类已经找到了多种自发免疫缺陷小鼠，可以用于移植人源肿瘤细胞，并且现在基因编辑技术如此火爆，重度免疫缺陷小鼠也完全是小case了好嘛~

异种移植模型的缺点就是需要使用免疫缺陷的小鼠进行建模，为了避免跨种属移植免疫系统的排斥反应。而重建人的免疫系统似乎又是无奈之举，不是小鼠本身的免疫系统，影响了免疫细胞的发育和成熟。同种移植肿瘤模型可以让研究者使用免疫系统健全的小鼠模型，但需要使用小鼠肿瘤细胞系进行建模研究。功能完整的免疫系统使得同种移植模型比异种移植模型能更好地模拟癌症的真实情况。

（1） 野生小鼠同种移植模型：主要应用于Surrogate抗体的药理药效研究

（2） 基因改造（人源化）小鼠模型：用于人源化抗体的研究

图2. 人源PD-1在小鼠基因组上的改造方案

2. 小鼠异种移植肿瘤模型及分类(人源肿瘤异种移植模型)

在肿瘤动物模型中，使用广泛的一种是小鼠异种移植肿瘤模型，该模型利用了特定的小鼠，如SCID，NSG，B-NDG鼠等常规免疫缺陷或者重度免疫缺陷小鼠，该类小鼠无法对外来细胞产生免疫攻击。有以下分类：

1） CDX模型（Cell-line-Derived Xenograft）：使用标准化的癌种细胞系进行建模，该类细胞培养方便，容易获得，不过有其缺点，就是不能代表原始临床肿瘤。

2） PDX模型（Patient-Derived Tumor Xenograft）：从肿瘤病人身上获得的肿瘤组织或细胞，虽然有其临床肿瘤的特点，该种组织不易获得，并且生长“繁育”周期比较久，成功率较低。

图1. 小鼠异种移植肿瘤模型示意图

抗体药物多数是通过介导免疫系统对肿瘤进行杀伤的，所以评价其有效性需要重建（Reconstitute）人免疫系统（包括DC，B，T，NK等）的动物模型。

表1. 小鼠异种移植肿瘤模型是否需要人的免疫系统重建

CDX

人源肿瘤细胞系异种移植（cell derived xenograft, CDX)，即将体外传代培养的肿瘤细胞接种至免疫缺陷小鼠，接种部位常为皮下，静脉或原位，如图3。

细胞系模型以体外培养的传代肿瘤细胞在免疫缺陷鼠体内接种而建立，由于细胞体外长期传代而呈现有高同源性特点，模型建立容易，重复性好，在肿瘤药物研发中仍有极大需求, 但在体外不断培养传代过程中，肿瘤异质性与原始肿瘤组织存在较大的差异，从而在预测临床药效方面不甚理想。

PDX

人源肿瘤组织来源移植瘤模型 (patient derived xenograft ，PDX)，通过将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型，常见接种部位为皮下，静脉，原位, 如图3。

与CDX相比，PDX移植所用标本直接来源于人体肿瘤组织，未经过体外培养，稳定地保留了肿瘤的遗传特性、组织学和表型特征，即肿瘤异质性，肿瘤的生长微环境更接近人体实际情况，筛药试验结果也具有较好的临床预见性。（详情参见往期推文：PDX与CDX）

但问题又来了，人体罹患的大部分肿瘤并不是在免疫缺失的情况下发生的，而为了防止接种的人源肿瘤在小鼠体内发生免疫排斥，CDX,PDX构建的小鼠模型又必须要求免疫缺陷。

有没有一种既包含人体免疫系统，又可接纳人源肿瘤的小鼠模型呢？

答案是：当然有！

目前应用于临床前的免疫系统重建技术主要分为两类：

  • 一是将成熟的人外周血单核细胞（hPBMC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型；
  • 另一类是将人骨髓衍生的CD34+造血干细胞（HSC）通过腹腔或者尾静脉注入免疫缺陷小鼠，即HSC（CD34+）型

3. 野生小鼠及宠物自发肿瘤模型

随着年龄的增长，小鼠和宠物大概率会发生肿瘤，这种自发肿瘤更接近人类癌症，对于临床的转化将更有意义。

图3. 体内外模型及临床转化

4. 利用基因人源化小鼠进行抗体药生物标记物的研究

开发创新药物需要对疾病、靶点及药理机制有更深入理解。基因人源化小鼠模型体内药效研究逐渐受到药企认可，那么如何利用它进行药理药代（PD/PK）的研究、怎样寻找合适的生物标记物，如何联系药理药代、动物模型和疾病状况之间的关系？如果想要回答这个问题，可能您又有一个疑惑是基因人源化小鼠是否可以作为研究PD/PK的模型。

这个问题目前很难给出明确的答案，仍需要药企，CRO及监管部门三方共同进行探索。需要验证什么是相关种属， FDA等监管机构要求临床前的动物实验必须使用相关种属，对于抗体药物的研究，除了需要和靶点结合外，更重要的是需要有药效PD活性，才能叫做相关种属。

五、其他

肿瘤细胞系CT26（结直肠癌细胞系）、MC38（结直肠癌细胞系）、4T1（乳腺癌细胞系）和B16F10（黑色素瘤细胞系）

参考资料

更多阅读：

  • [1] https://www.soogif.com/compress

  • [2] Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261.

  • [3] Zitvogel L, Pitt JM, et al. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 2016 Dec;16(12):759-773.

  • [4] Walsh NC, Kenney LL,et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:187-215

  • Cancer incidence and mortality in China,2016; Journal of the National Cancer Center

  • Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261.

  • Jackson, E.L., Willis, N., Mercer, K., Bronson, R.T., Crowley, D.,Montoya, R., Jacks, T., Tuveson, D.A., 2001. Analysis oflung tumor initiation and progression using conditionalexpression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243e3248.

  • Su L K , Kinzler K W , Vogelstein B , etal. Corrections and Clarifications: Multiple Intestinal Neoplasia Caused By aMutation in the Murine Homolog of the APC Gene[J]. Science, 1992,256(5060):1114-1114.

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