【9.2.1.2】核酸纯度（A230/A260/A280）
我们通过紫外分光计来测定浓度，测定后看A260/A280值，这个值是判断质粒是否污染的重要标准，一般在1.8-2.0左右，如果低于1.8表示有蛋白质污染。
一、蛋白质DNA为什么能吸收紫外
这是因为DNA中的嘌呤和嘧啶具有共轭双键，-C=C-C=C-，蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，根据共轭双键的数目和种类就会主要吸收（DNA主要吸收260nm，并不代表其他波长就不吸收了）不同波长的紫外，至于为什么会这样，这就是大一学的无机化学里介绍的，会涉及到电子轨道、共轭、大π键等等，科研狗不愿多说，说多了都是泪。
二、纯的DNA紫外吸收波段是怎样的？
上图中大概是碳水化合物（230），DNA（260），蛋白质（280）的紫外吸收示意图（请忽略<200nm或者>400nm波长的曲线）。
三、为什么纯的DNA紫外吸收A260/A280在1.8左右？
正如上图所示，因为DNA的吸收曲线是比较固定的，因此V1/V2既（A260/A280）比值基本恒定，这个比值在1.8左右，所以我们常说的A260/A280的1.8的值就是由此而来。
最后：含有蛋白质污染的DNA自我吸收图谱是怎样的？
上图事宜了DNA中含有蛋白质污染了，因为蛋白质吸收波长主要在280左右，这会导致曲线会在280处有一个上升的趋势，使得V1'/V2' 的比值下降，既我们常说的”如果A260/A280小于1.8，则有蛋白质污染“。
在测定中我们经常还会看见A260/A230，A230是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染。
四、那A260/A280 、A260/A230到底有何意义？
A260/A280 、A260/A230 是核酸纯度的指示值。 纯净的样品 A260/A280 大于1.8（DNA）或者 2.0（RNA）.如果比值低于 1.8 或者 2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。
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参考分子克隆指南三，当 0.5％ BSA 蛋白质污染时，蛋白污染会导致 A260 和 A280 的数值都下降，其净结果是 A260/280 比值下降，但 A260/280的比值变化并不显著。但蛋白残留会导致 A230 的数值显著上升，显著影响 A260/230 的比值。
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也就是说，如果 RNA 样品的 A260/280＝1.7，A260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留。
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酚的最大吸收峰在 270 nm。酚的残留会显著的增加 A230、A260 、A280 的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰向270方向偏移， 也就是说最大吸收峰在 270 nm附近。也就是说，如果 RNA 样品的 A260/280=1~1.5，260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。
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胍盐对 RNA 样品吸收有显著影响，会在小于 230 nm处产生大的吸收峰。胍盐残留不会影响 260 和 280 的数值，对 260/280 的比值不会造成大的影响，当然也不影响RNA定量。但胍盐残留对 A260/230 比值具有明显影响。比如 A260/230 的比值小于 0.21 时，A260/280 的比值还>2。
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也就是说，如果 RNA 样品的 A260/280>=2，A260/230<1，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。
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当 A260/230<1时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。
用分光光度计测量 RNA 时，用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品会造成 A260/A280 比值下降。原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。
加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多 ，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取 400 uL 左右。
参考资料
