【2.5】CcdB - 高效克隆的关键

如果您对克隆感兴趣,您可能知道目前有几种方法可以用来进行克隆。其中包括传统的限制性内切酶/连接酶介导的方法、最近开发的Gibson Assembly Cloning和Gateway® 克隆技术,以及其他几种技术。每种方法都是独一无二的,并依赖于对克隆反应至关重要的特定组件。了解特定成分对于为您自己的实验选择正确的克隆方法至关重要,在这里我们将重点关注一个独特的基因,它使流行的 Gateway TM方法成为可能:ccdB。但什么是ccdB,它在现代克隆中扮演什么角色,你为什么要更多地了解它?

传统克隆最耗时的方面之一是识别实际包含您感兴趣的插入片段的克隆。简单地说,ccdB通过选择不占用插入片段的载体使克隆更容易。但是ccdB究竟是如何做到这一点的呢?让我们从基因的简史开始,以及分子生物学家如何利用它来发展克隆技术

CcdB:一种强效毒素…

ccdB pKIL18/19 质粒图谱的ccdB的基因,位于的F-因子性别质粒E. 大肠杆菌,由CCD操纵子,其负责细胞分裂过程中质粒维持编码的毒素-抗毒素系统的一部分。ccdB编码有毒蛋白质 (CcdB),它充当 DNA 回旋酶毒物(gyrase poison),将 DNA 回旋酶与断裂的双链 DNA 锁定并最终导致细胞死亡。ccdA是在 ccd 操纵子中发现的另一个基因,它编码抗毒素蛋白 (CcdA),可保护细胞免受有毒 CcdB 的侵害。通过丢失 F 质粒而丢失ccdA 的细胞会屈服于 CcdB 的毒性

…成为强大的克隆工具

大约 20 年前,分子生物学家首先看到了该系统在提高克隆效率方面的潜力,并开发了克隆载体来利用它。这些称为 pKIL18 和 pKIL19 的载体包含与 MCS 框内的ccdB基因。用空载体转化的大肠杆菌表达ccdB基因,因此无法繁殖,因为 CcdA 无法抵消毒素。然而,如果研究人员成功地将插入片段克隆到载体中,ccdB阅读框将被破坏,从而使表达重组质粒的细胞得以繁殖。任何包含非重组载体(例如重新连接的空载体)的细胞仍会表达ccdB因此会死。这一过程大大减少了不含重组质粒的克隆数量,因此使克隆过程更加高效,因为人们不必彻底筛选插入片段的菌落。

Gateway® 技术(由Invitrogen TM开发)本质上是这个旧系统的一个更现代的版本,增加的优势将在单独的帖子中详细讨论。关注ccdB方面,Gateway 利用了相同的原理,即细胞在表达基因时不会繁殖。简而言之,该系统中的向量“骨干”包含ccdB。成功的插入将完全取代ccdB与调查员感兴趣的插入。因此,正确克隆的识别效率要高得多,因为那些不包含所需插入片段的克隆不应生长

CcdB 抗性大肠杆菌菌株完善系统

但是ccdB本身并不是该系统的唯一关键——如何使用质粒/基因杀死表达它的细胞?答案在于能够耐受毒素基因表达的特殊大肠杆菌菌株。一种这样的菌株是DB3.1,它包含 DNA 促旋酶 (gyrA462) 的突变版本,可以抵抗 CcdB 的毒性作用。另一种可商购的 CcdB 抗性菌株是来自 Invitrogen TM 的ccdB Survival™。使用 DB3.1 或 ccdB Survival TM,可以有效地繁殖和制备含有ccdB 的质粒基因,然后可用于下游克隆应用。虽然这两种菌株最终执行相同的功能,但有证据表明 ccdB Survival™ 可能更难以转化,具体取决于所使用的特定质粒。

我们还想指出,虽然 DB3.1 和 ccdB Survival 菌株是专门针对含 ccdB 的载体开发的,但任何包含 F 质粒(F’ 菌株)的质粒也将对 CcdB 具有抗性,因为天然 ccdA将在场。大多数常见的大肠杆菌克隆菌株不包含 F 质粒(并被认为是 F-);但是,有一些流行的实验室菌株,例如 NEB Stable、JM109、XL1 Blue 或 XL10 Gold,它们是 F’。这些菌株可能用于繁殖和制备含有 ccdB 的空骨架,但在选择重组质粒时不应使用。

参考资料

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