【7.2.1】细菌质粒提取
细胞中存在蛋白质，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我们的目的是把质粒DNA给拽出来，而且不能掺杂其他的生物大分子。蛋白质可以让它沉淀，RNA可以加入RNase降解，可以看出，质粒提取最关键的问题是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA给区分开来。
非裸露的，上面结合有多种NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因转录活性可以改变拟核的形态结构。相对之下，plasmid DNA就要简单很多，游离于细胞质中，以共价闭环cccDNA（convalently closed circular DNA ）的形态存在
有研究报道，PH在12.0-12.5，非常窄的范围内，line DNA会发生变性，而cccDNA不会发生变性。正是基于此，1979年，J.Doly发表文章a rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是经常说的碱裂解法。The principle of alkaline extraction就是选择性地让chromosomal DNA发生变性，而plasmid DNA不会发生变性，仍然以双链形式存在。
接下来，详细看看，我们在提取质粒时，每一种溶液成分所起到的作用。在这里，溶液成分以J.Doly文章中为依据，基本和我们日常采用的试剂盒的溶液成分是相同的。
在溶液Ⅰ中：
Lysozyme可以溶解细胞壁，对于一些细胞壁比较厚的细菌，加入Lysozyme，是不错的选择，但是我们日常提取质粒的试剂盒似乎在溶液Ⅰ中没有添加Lysozyme。
EDTA或者CDTA是金属离子螯合剂，能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，细胞壁最外层是脂多糖LPS，携带负电荷。要维系LPS的稳定性，必须要有足够多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就会使LPS解体，暴露出内层的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是细胞膜的重要成分，同时，对于细胞内很多酶的活性至关重要。EDTA可以破坏细胞膜，抑制细胞内许多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。
Glucose可以给细胞一个osmotic shock(渗透压)，导致细胞壁和细胞膜裂解，还有一种说法，Glucose可以增加溶液的黏稠度。使细胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句，用Glucose可以更精确控制溶液PH，不太明白其中的原理。
在溶液Ⅱ中：
SDS能够破坏细胞壁，让细胞内容物(Lysate)释放出来，还可以使蛋白变性，性，结合到蛋白质表面。在这个过程中，chromosomal DNA会被降解成线性片段，一旦遇到强碱（12.0-12.5），chromosomal DNA会发生变性分离变成单链，但是plasmid DNA对此PH范围耐受，仍然以双链形式存在。
在溶液Ⅲ中：
加入醋酸钠可以中和强碱，chromosomal DNA发生复性，但是无法恢复原来天然的双链结构，而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心，SDS-protein-chromosomal DNA复合物，其他的细胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。
这张图不是很清晰，但是描述原理很清楚，非常有助于理解。
后面的步骤就很简单了，一般来说都是过柱子或者磁珠吸附，plasmid DNA会吸附在柱子上，然后用70%乙醇把盐洗掉，再用水把plasmid DNA从柱子上洗脱下来就可以了。
参考资料
