【7.2.1】细菌质粒提取

细胞中存在蛋白质,chromsomal DNA,plasmid DNA,RNA,我们的目的是把质粒DNA给拽出来,而且不能掺杂其他的生物大分子。蛋白质可以让它沉淀,RNA可以加入RNase降解,可以看出,质粒提取最关键的问题是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA给区分开来。

非裸露的,上面结合有多种NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因转录活性可以改变拟核的形态结构。相对之下,plasmid DNA就要简单很多,游离于细胞质中,以共价闭环cccDNA(convalently closed circular DNA )的形态存在

有研究报道,PH在12.0-12.5,非常窄的范围内,line DNA会发生变性,而cccDNA不会发生变性。正是基于此,1979年,J.Doly发表文章a rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是经常说的碱裂解法。The principle of alkaline extraction就是选择性地让chromosomal DNA发生变性,而plasmid DNA不会发生变性,仍然以双链形式存在。

接下来,详细看看,我们在提取质粒时,每一种溶液成分所起到的作用。在这里,溶液成分以J.Doly文章中为依据,基本和我们日常采用的试剂盒的溶液成分是相同的。

在溶液Ⅰ中:

Lysozyme可以溶解细胞壁,对于一些细胞壁比较厚的细菌,加入Lysozyme,是不错的选择,但是我们日常提取质粒的试剂盒似乎在溶液Ⅰ中没有添加Lysozyme。

EDTA或者CDTA是金属离子螯合剂,能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。大肠杆菌是革兰氏阴性菌,细胞壁最外层是脂多糖LPS,携带负电荷。要维系LPS的稳定性,必须要有足够多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+,就会使LPS解体,暴露出内层的肽聚糖,因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是细胞膜的重要成分,同时,对于细胞内很多酶的活性至关重要。EDTA可以破坏细胞膜,抑制细胞内许多酶的活性,比如核酸酶,防止DNA被降解掉。

Glucose可以给细胞一个osmotic shock(渗透压),导致细胞壁和细胞膜裂解,还有一种说法,Glucose可以增加溶液的黏稠度。使细胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句,用Glucose可以更精确控制溶液PH,不太明白其中的原理。

在溶液Ⅱ中:

SDS能够破坏细胞壁,让细胞内容物(Lysate)释放出来,还可以使蛋白变性,性,结合到蛋白质表面。在这个过程中,chromosomal DNA会被降解成线性片段,一旦遇到强碱(12.0-12.5),chromosomal DNA会发生变性分离变成单链,但是plasmid DNA对此PH范围耐受,仍然以双链形式存在。

在溶液Ⅲ中:

加入醋酸钠可以中和强碱,chromosomal DNA发生复性,但是无法恢复原来天然的双链结构,而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心,SDS-protein-chromosomal DNA复合物,其他的细胞裂解物全部沉淀管底,只有plasmid DNA溶解在上清中。

这张图不是很清晰,但是描述原理很清楚,非常有助于理解。

后面的步骤就很简单了,一般来说都是过柱子或者磁珠吸附,plasmid DNA会吸附在柱子上,然后用70%乙醇把盐洗掉,再用水把plasmid DNA从柱子上洗脱下来就可以了。

参考资料

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