【5.1.2】Flag-tag
1. 什么是Flag标签？
Flag-tag 是一种常用的表位或肽标签，并非源自天然蛋白质。Flag-tag 是一种人工标签，基于肽序列，也称为 DYKDDDDK-tag。Flag-tag 用于标记蛋白质以用于多种捕获和检测应用。
2. Flag-tag 是如何工作的？
使用与标记结合的抗标记抗体研究标记标记的蛋白质。 Flag-tag 是在 N 端或 C 端克隆到感兴趣的蛋白质上。表达后，重组Flag-tag融合蛋白可以通过ELISA、流式细胞术、免疫荧光（IF）、免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白质纯化和蛋白质印迹（WB）进行分析。
三、Flag-tag的结构
Flag-tag 八肽的结构
4、Flag-tag的开发与发现
Flag标签首先由 Hopp et al. (1988)*.
5. 属性
Flag-tag 包含 8 个氨基酸 (aa) 并具有序列基序 NH2-DYKDDDDK-COOH (Asp-Tyr-Lys-Asp-. Asp-Asp-Asp-Lys)。该序列包含一个肠激酶切割位点 (DDDDK)。肠激酶的切割从标记标记的蛋白质中去除Flag-tag 。除了 1x Flag-tag 之外，3x Flag-tag 也是常用的。最常用的序列基序不是 1x Flag 序列的简单重复：DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK。
6. 如何标记蛋白质？
与其他蛋白质和肽标签一样，Flag-tag 附着在感兴趣的蛋白质 (POI，protein of interest) 上。通常，Flag-tag 被克隆到 DNA 质粒中的 POI 的框架内。然后将重组 DNA 质粒用于转染。
7. Flag-tag 和 3x Flag-tag 的大小
Flag-tag
- 氨基酸数：8
- 分子量 (MW)：1012.98 Da
3x Flag-tag
- 氨基酸数：22
- 分子量 (MW)：2730.71 Da
8. Flag-tag 和 3x Flag-tag 的规格
Flag-tag：
- 理论等电点（pI）：3.97，反映氨基酸残基带负电程度高。Flag-tag 共有七种带电氨基酸，带电。
- 带负电荷的残基总数（Asp + Glu）：5
- 带正电荷的残基总数（Arg + Lys）：2
- 带电荷的残基总数：7。
3x Flag-tag：
- 理论 pI：4.16
- 带负电残基总数（Asp + Glu）：11
- 带正电残基总数（Arg + Lys）：2
- 带电残基总数：13。
9. * 标签表位标签序列
Flag-tag
Flag-tag 氨基酸序列： DYKDDDDK
标记标签 DNA 序列： GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG
3x Flag-tag
3x Flag-tag氨基酸序列： DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK
3x 标记氨基酸序列：
GAC TAC AAG GAC CAC GAC GGT GAC TAC AAG GAC CAC GAC ATC GAC TAC AAG GAC GAC GAC GAC AAG TGA
D=天冬氨酸；G=甘氨酸；H=组氨酸；I = 异亮氨酸；K=赖氨酸；Y=酪氨酸
10. 什么时候应该使用 3x Flag，什么时候应该使用 1x-Flag-tag？
这个问题没有简单的答案。3x Flag-tag 长度的增加增加了 anti-Flag 抗体/亲和试剂的亲和力。3x Flag-tag 常用于串联纯化和蛋白质纯化。如上所述，3x-Flag-tag 比 1x-Flag-tag 更长，并且具有更多带电氨基酸。带负电荷和带正电荷的氨基酸可能更强烈地干扰 POI，并可能影响蛋白质表达。
对于Western blot的检测，1x Flag-tag 就足够了。
11、为什么Flag-tag也叫DYKDDDDK-tag？
FLAG 是 Sigma-Aldrich Co. LLC 的注册商标。其他供应商可能会将 Flag-tag 称为 DYKDDDDK-tag。
12. 应用程序
虽然 Flag-tag 已被开发为用于 IP 和蛋白质纯化以及免疫印迹的捕获标签，但它也用于免疫荧光。
13. Flag- vs. Myc-tag
Flag-tag 和 Myc-tag 的比较
Flag标签 Myc标签
起源 - 人类c-Myc
3D结构
氨基酸序列 DYKDDDDK EQKLISEEDL
氨基酸数 8 10
分子量（Da） 1012.98 1203.31
理论等电点 (pI) 3.97 4.00
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu) 5 4
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys) 2 1
14. Flag-tag 和 HA-tag 的比较
Flag标签 HA标签
起源 - 人流感血凝素（HA）来源于人流感病毒
3D结构
氨基酸序列 DYKDDDDK YPYDVPDYA
氨基酸数 8 9
分子量（Da） 1012.98 1102.17
理论等电点 (pI) 3.97 3.56
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu) 5 2
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys) 2 0
15. Flag-tag 和 Spot-Tag 的比较
Flag标签 现货标签
起源 - 源自人类β-连环蛋白
3D结构
氨基酸序列 DYKDDDDK PDRVRAVSHWSS
氨基酸数 8 12
分子量（Da） 1012.98 1396.53
理论等电点 (pI) 3.97 10.03
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu) 5 1
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys) 2 2
16. Flag-tag 和 V5-tag 的比较
Flag标签 V5-标签
起源 - 猿病毒5的P和V蛋白
3D结构
氨基酸序列 DYKDDDDK GKPIPNPLLGLDST
氨基酸数 8 14
分子量（Da） 1012.98 1421.66
理论等电点 (pI) 3.97 5.84
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu) 5 1
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys) 2 1
17. 如何洗脱Flag-tagged蛋白？
Flag-tag 融合蛋白可以通过以下方法洗脱
- 使用 Flag 肽进行竞争性洗脱：1x Flag 肽或 3x Flag 肽。
- 请注意，1x Flag 肽段不会洗脱 3x Flag 标记的蛋白质
- 用甘氨酸 (pH2.5) 进行酸性洗脱
- SDS 样品缓冲液
18. Flag-tag plasmids
用于表达包含哺乳动物细胞、果蝇等的多克隆位点 (MCS) 的标记标签的载体可从包括默克 (Sigma Aldrich) 和 Novus Biologicals 在内的许多供应商处获得。Addgene 也是一个来源。
19. 有哪些抗Flag-tag抗体，有哪些抗DYKDDDDK抗体？
重组、单克隆和多克隆抗Flag抗体可从多家供应商处获得。ChromoTek提供即用型DYKDDDDK Fab-Trap™，用于对标记标记的蛋白质进行高效和高纯度的免疫沉淀。
Proteintech提供已针对不同应用（包括免疫荧光 (IF)、免疫沉淀 (IP)、ELISA 和蛋白质印迹 (WB)）进行验证的自制抗Flag 抗体：
参考资料
