【4.3】我应该使用哪种荧光蛋白

荧光蛋白 (FP) 于 50 多年前首次被发现，当时发现了绿色荧光蛋白 (GFP)，这是一种来自维多利亚水母的蛋白质。自那次发现以来，FP 家族不断扩大，有数百种可用变体。继续阅读以熟悉可用的 FP 发射颜色和在为即将进行的实验选择 FP（或两个）时要记住的 10 点。

荧光是吸收光的物质发出的光。发射光的波长比激发波长长。因此，FP 是具有这种独特能力的蛋白质。

当在大多数生物体中异位表达时，这些 FP 中的许多是荧光的。此外，将 FP 与另一种蛋白质融合通常不会影响其荧光。因此，FP 被用于研究许多生物学问题。两种最常见的用途是： 1) 测试特定系统中的表达水平（通过测量荧光强度）；和 2) 可视化 FP（与感兴趣的蛋白质融合）的定位，从而跟踪该生物分子在活细胞内的定位。

按发光颜色分类的 FP（发光波长范围）

FP 通常按发射颜色分类，如下所述（或发射波长范围）。通过突变 GFP，衍生出蓝色 FP (BFP)、 青色 FP (CFP) 和 黄色 FP (YFP)的变体 。要了解 GFP、它的变体及其相关突变，请查看Marcy 上周在 GFP 上的帖子。此外，在其他生物体中也发现了许多其他 FP。

除了发射波长范围外，在选择 FP 时还需要考虑其他特性：

独特的荧光蛋白类别

光活化/光转换 (Photoactivatable / Photoconvertible)：当被特定的激发波长激活时，这些蛋白质可以改变它们的颜色。这意味着发射波长可以改变。在少数情况下，蛋白质的初始状态是无荧光的，因此允许非常低的荧光背景水平。这种光活化或光转化蛋白质的例子是 PA-GFP、Dendra2 和 mEOS 蛋白质。一些蛋白质是可逆转换的（例如 rsEGFP、Dreiklang）。

荧光计时器 (FT,Fluorescent Timers：这些蛋白质会随着时间的推移而改变颜色。因此，这些可以用作激活后细胞过程的“计时器”。四种主要的 FT 称为慢速 FT、中型 FT、快速 FT 和 mK-GO。

大斯托克斯位移 (LSS,Large Stokes Shift )：斯托克斯位移（以George G. Stokes命名）是波长从激发到发射的位移。对于大多数 FP，斯托克斯位移小于 50nm（通常要小得多）。对于 LSS 蛋白质，斯托克斯位移≥ 100nm。具体来说，这些蛋白质被紫外光或蓝光激发，它们的发射是绿光或红光。例如，T-Sapphire、LSSmOrange 和 LSSmKate。

荧光传感器(Fluorescent Sensors:)：这些 FP 会根据环境变化（例如 pH、Ca 2+通量等）改变其激发/发射行为。最常用的是 GECI - 基因编码的钙指示剂（例如 GCaMP）。其他包括：pHluorin & pHTomato（pH 传感器）、HyPer（H 2 O 2传感器）、ArcLight（电压传感器）和 iGluSnFr（谷氨酸传感器）。更多关于这些生物传感器的例子可以在 Addgene 找到。

分裂 FPs(Split FPs )—— 一些 FPs（例如 GFP、Venus）可以分成两半，它们本身不发荧光。如果两半靠得很近，它们将形成完整的 FP 并发出荧光。分裂 FP 可用于确定融合到分裂 FP 两半的两种蛋白质的接近程度。这种技术也称为双分子荧光互补 (BiFC)。

选择荧光蛋白时要牢记的8点

1. 激励和发射（ex/em）：

• 每个 FP 都有其独特的 ex/em 峰。因此，选择您的系统可以激发的 FP，并检测发射。例如，如果您的显微镜只有两个激光器，分别为 488nm 和 561nm，您将无法使用远红光 FP。如果您没有将蓝光传递到检测器/相机的过滤器，那么 BFP 对您毫无用处。

• 当使用多个 FP 时，确保它们的发射光在波长上不重叠。在许多显微镜中，滤光片不够窄，无法区分密切相关的颜色。此外，大多数 FP 具有广泛的发射范围，可被更长波长的滤光片检测到（例如 GFP 也发射黄光）。

• 请注意，某些 FP 组合会导致称为FRET（荧光 [或 Förster] 共振能量转移）的效应。当来自一个 FP（例如 CFP）的能量转移激发另一个 FP（例如 YFP）的荧光时，就会发生 FRET。FRET 仅在两个 FP 之间的距离 <10nm 时发生，并且在标记相互作用的蛋白质时应予以考虑。事实上，FRET 通常用于确定两种蛋白质是否相互作用。

2. 寡聚化：第一代 FP 易于寡聚化。这可能会影响 FP 融合蛋白的生物学功能。因此，建议使用单体 FP（通常用“m”表示作为蛋白质名称的第一个字母，例如 mCherry）。

3. 氧气：许多 FP（特别是那些源自 GFP 的）发色团的成熟需要氧气。因此，这些 FP 不能用于缺氧环境。最近，从鳗鱼中分离出的一种新的 GFP 被证明可以独立于氧气而成熟，因此适合在厌氧条件下使用。

4. 成熟时间：成熟时间是指 FP 正确折叠并生成发色团所需的时间。这可以从转换后的几分钟到几个小时。例如，超级文件夹 GFP (sfGFP) 和 mNeonGFP 在 37°C 下可以在 <10 分钟内折叠，mCherry 需要约 15 分钟，TagRFP 需要约 100 分钟，而 DsRed 需要约 10 小时。

5. 温度： FPs 的成熟时间和荧光强度会受到温度的影响。例如，增强型 GFP (EGFP) 针对 37°C 进行了优化，因此最适合哺乳动物或细菌研究，而 GFP S65T更适合酵母研究 (24-30°C)。

6. 亮度： 亮度是衡量发射光亮度的指标。亮度计算为蛋白质的消光系数和量子产率的乘积除以 1000。在许多情况下，亮度与设置为 1 的 EGFP 的亮度进行比较。一些蛋白质非常暗（例如 TagRFP657，具有亮度0.1），应该考虑到这一点。 光稳定性会受到实验参数（例如激发光强度、pH 值或温度）的影响。

7. 光稳定性：荧光分子在长时间暴露于激发光后会变白（即失去发光能力）。光稳定性可短至 100 毫秒 (EBFP) 或长至 1 小时 (mAmetrine1.2)。但是，对于大多数 FP，它是几秒到几分钟。光稳定性会受到实验参数（例如激发光强度、pH 值或温度）的影响。

8. pH 稳定性：如果您计划在酸性环境中表达 FP（例如酵母细胞质，微酸性，或突触小泡），则此参数很重要。一些 FP 具有不同的 ex/em 光谱（例如 mKeima）或在 pH 变化时改变荧光强度（例如 pHluorin、pHTomato）。

参考资料

• https://blog.addgene.org/which-fluorescent-protein-should-i-use