【4.4】选择用于多色成像的荧光蛋白
活细胞成像(live cell imaging )实验的一个共同要求是能够同时跟踪多个荧光标记的物种。要使用荧光蛋白标签做到这一点，需要多个荧光蛋白，其激发和发射光谱的差异足以使它们在显微镜上的不同荧光通道中成像。随着近年来荧光蛋白的激增，可以一起成像的荧光蛋白组合有很多，但这也意味着荧光蛋白的选择需要一些思考。
选择兼容的荧光蛋白
要选择一组要一起成像的荧光蛋白，您需要考虑与选择单个荧光蛋白时相同的因素（亮度、光稳定性等； 有关这些因素的更多讨论，请参阅 上一篇博文）。此外，您还需要选择可以相互区分并且可以用您打算使用的显微镜上的光学器件成像的荧光蛋白。准确确定两种荧光蛋白是否可以相互分离需要了解它们的激发和发射光谱，但一个好的经验法则是两种蛋白质的峰值激发波长和峰值发射波长应相隔 50- 60 纳米。例如，CFP (ex 430 nm / em 474 nm) 和 YFP (ex 514 nm / em 527 nm) 可以一起成像，但 CFP 和 GFP (ex 488 nm / em 507 nm) 显示两种荧光蛋白之间的一些串扰。如果您必须对光谱重叠的荧光蛋白进行成像，可以使用光谱分离等技术来分离荧光蛋白，但这些超出了本文的范围。
您的荧光蛋白是否与您的显微镜光学元件兼容？
要确定您感兴趣的荧光蛋白是否与您的显微镜光学器件兼容，您需要将蛋白质的激发和发射光谱与显微镜上的滤光片组或激光器进行比较。理想情况下，您希望激发和发射滤光片与蛋白质的激发和发射光谱之间有大量重叠，以便蛋白质被显微镜充分激发，并且蛋白质的荧光发射被显微镜有效收集。为了比较荧光蛋白和滤光片组之间的匹配，许多滤光片组供应商提供了绘制蛋白质和染料及其滤光片的荧光光谱的工具（参见 Chroma’s、 Semrock’s或 Omega’s）。虽然这些不包含所有常用的荧光蛋白（特别是不是最近发表的），但它们可以是一个很好的起点。在许多情况下，如果您知道您感兴趣的蛋白质具有相似的光谱，则对密切相关的蛋白质使用光谱就足够了。例如，以下是 Chroma Spectra Viewer 的屏幕截图，将标准 Cy3 或罗丹明过滤器组 (Chroma #49004) 与 mCherry 和 TagRFP 的光谱进行了比较。
在这里，TagRFP 光谱以较深的颜色显示，而 mCherry 光谱以较浅的颜色显示；激发光谱为蓝色，发射光谱为红色。两者都不是与过滤器集的完美匹配，但激发过滤器激发了更多的 TagRFP 激发峰，发射过滤器收集的 TagRFP 发射比 mCherry 发射更大。对于此过滤器组，我们希望 TagRFP 提供比 mCherry 更亮的信号。一般来说，为罗丹明(Rhodamine)/Cy3 设计的滤光片组在处理较短波长的红色荧光蛋白（如 TagRFP 或 mRuby2）时效果比较长波长的蛋白质（如 mCherry）效果更好。有关荧光和滤光片组的背景信息，请参阅 iBiology 的荧光显微镜简介 讲座 。
常用过滤器组和相关荧光蛋白
用于多色成像的常用滤镜组包括专为 CFP、YFP 和 RFP 设计的滤镜组或 Sedat Quad 滤镜组，专为 DAPI / 荧光素 / 罗丹明 / Cy5（例如 Semrock 的) (DAPI / Fluorescein / Rhodamine / Cy5) 和类似的 4 激光组合在共焦 (405 / 488 / 561 / 640 nm) 上。在我们的手中，用于此组成像的最佳荧光蛋白是 mTagBFP2、EGFP 或改进的 GFP 变体之一、mRuby2 或 TagRFP-T，以及红外荧光蛋白，如 iFP1.4 或 iFP2.0。请注意，这些红外荧光蛋白需要胆绿素作为辅助因子，因此您可能需要用胆绿素补充细胞以获得最大亮度。在哺乳动物细胞中，一种改进的 EGFP 折叠变体，如 meEmerald 或 Clover，可能是最好的；mNeonGreen 是一种更新的绿色荧光蛋白，应该非常明亮。在 酿酒酵母中，我们已经使用该滤光片组测试了许多绿色和红色荧光蛋白，并 报告了亮度测量结果. 在这里，EGFP 优于改进的折叠变体，大概是由于较低的生长温度。然而，这也表明，没有对所有生物体都是最佳的单一荧光蛋白，如果您想要最亮的信号，您可能需要在您感兴趣的系统中尝试几种蛋白质。最后，在这组蛋白质中，绿色和红色蛋白质通常是最容易检测到的，因此应该用于标记含量最低的蛋白质，蓝色和红外通道用于更丰富的蛋白质或标记隔室。
我希望这对荧光蛋白的多色成像有所启发。使用正确的显微镜和正确选择的荧光蛋白，同时对四种颜色进行成像应该非常简单。
参考资料
