【2.6】Gateway克隆
当面临克隆项目时，科学家们不再局限于传统的限制性内切酶克隆。相反，您可以 选择一种在给定资源、时间和实验需求下运行良好的分子克隆技术。自 1990 年代后期发明以来，Gateway 克隆技术作为将 DNA 序列转移到多个载体系统中的一种快速高效的方式已变得非常流行。通过适当的入口和目标载体，人们可以使用 Gateway 将感兴趣的基因克隆到各种表达系统中
Gateway技术简介
由Invitrogen开发的 Gateway 克隆方法是λ 噬菌体感染细菌时发生的整合和切除重组反应的体外版本。 在体内，这些重组反应是由噬菌体 ( att P ) 和细菌 ( att B )附着位点的重组促进的。由于 attP 和 attB 位点之间的重组，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧是两个新的重组位点 （att L -left- 和att R -right-，图 1）。在一定条件下，attL和att R位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除，att P和att B位点再生。
Gateway 载体包含att位点的修改版本，因此科学家可以轻松克隆到他们想要的 DNA 序列中。Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：
在BP反应取之间发生ATTB sites侧翼插入和ATT P供体载体。该反应由 BP Clonase 酶混合物催化，并生成包含目标 DNA的入口克隆，其两侧是att L位点。作为反应的副产物，从供体载体中切除ccd B基因。
在LR反应取之间发生ATT大号所产生的进入克隆的位点和ATT ř目标向量的位点。该反应由 LR Clonase 酶混合物催化。结果，产生了带有侧翼为att B位点的目标 DNA的 表达克隆。与 BP 反应一样， 包含ccd B基因的 DNA 片段 从目标载体中切除。
一旦进行了 BP 和/或 LR 反应，下一步就是转化感受态大肠杆菌细胞并选择阳性克隆。入口克隆和目标载体携带不同的抗生素抗性标记（此处用质粒颜色表示），让您轻松选择表达克隆。您还需要使用 对CcdB敏感的大肠杆菌菌株（例如DH5α、TOP10、Mach1 ）。CCDB基因是存在于供体载体 和目的向量重组前，它与感兴趣期间BP或LR反应中的基因交换。由于 CcdB 蛋白 抑制了 CcdB 敏感的生长大肠杆菌菌株，大多数菌落应包含所需的重组构建体。
如何使用Gateway技术进行克隆
为了更好地理解该过程，我们将通过一个示例实验，在该实验中我们可能会使用 Gateway 克隆来生成我们想要的构建体：人类 KRAS 基因在哺乳动物细胞中的慢病毒表达。
步骤 1：生成条目克隆 Generate an Entry Clone
有几种不同的方法可以生成我们想要的入门克隆——人类KRAS两侧是attL位点。
方法 A：将att B - PCR 产物或质粒与att P供体载体重组。在这种情况下，我们将使用 PCR 将att B位点添加到KRAS编码序列的任一端。如果您选择此策略，重要的是要包含正确的蛋白质表达元件（核糖体识别序列、起始密码子、终止密码子、阅读框注意事项等）。该视频演示了如何使用Snapgene 程序 设计Gateway 质粒。
方法 B： 将所需插入片段的TOPO 克隆到att L -entry-TOPO 载体中。TOPO 克隆添加了短端以促进克隆到包含att L的入口载体中。
方法 C：限制性克隆包含目标 DNA 和att L入口载体的限制性内切酶片段。该片段被插入到含有att L的入口载体的多克隆位点 (MCS) 中。
专业提示： Addgene 还为许多流行基因提供现成的入门克隆，包括Hs.KRAS4a
步骤 2：生成表达式克隆
在制作表达克隆时，选择最适合您的实验的目标载体很重要。这种选择将取决于许多因素，例如您的生物体、所需的表达水平和实验目的。对于哺乳动物慢病毒表达，我们可以使用像pLenti CMV Puro DEST (w118-1)或强力霉素诱导的pLIX_402 这样的载体。所选择的ATT ř目的载体将重组的在吨大号-entry克隆来创建表达克隆。
第 3 步：表达您感兴趣的基因！ 请务必通过测序或限制性消化来验证您的表达克隆的完整性！然后，您可以转化或转染您想要用于实验的细胞，并验证您的构建体是否具有功能。
Gateway 克隆方法的优点
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兼容性和灵活性
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使用感兴趣的 DNA 序列生成入门克隆后，只需一个重组步骤，您就可以在任何表达系统中移动该 DNA 片段。Addgene 的现成入门克隆可用于多种质粒。
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速度
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Gateway 系统仅在 1 天内即可生成表达构建体，而传统的限制性和连接克隆需要 2 天以上。还可以在同一管中设置 BP 和 LR 反应，加速att B- PCR 产物直接克隆到目标载体中。克隆过程很简单——不需要限制、连接或凝胶纯化步骤！
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多片段克隆
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您可以使用 Gateway 克隆将多个 DNA 片段一次插入到同一管中的多个载体中。您最多可以将 4 个 DNA 片段以特定顺序和方向在一个管中克隆到一个 Gateway 载体中，以产生所需的表达克隆。由于Gateway向量的设计，这成为可能。他们修改了att B、P、L和R位点的版本，这些位点非常特异性和定向地重组：att B1位点仅与attP1 位点发生反应；attB2 仅与attP2，attL1 仅与attR1；attL2 仅与attR2，依此类推。看看一些可在Addgene公司的Gateway多地点质粒，包括弗鲁实验室的多慢病毒表达系统（MULE）试剂盒，该多点会议Gateway克隆试剂盒，以及多站点Gateway质粒。
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恒定阅读框
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当您将 DNA 片段从一个 Gateway 载体移动到另一个载体时，插入的 DNA 片段会保持在框架内。
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高效率
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用于 Gateway Cloning 的阳性（抗生素）和阴性 (CcdB) 选择标记可将克隆效率提高至 >99%。
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普遍性
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可以克隆所有类型的 DNA 片段：PCR 片段、cDNA 或基因组 DNA，可用于从哺乳动物到大肠杆菌的所有生物体
Gateway 克隆载体词汇表
参考资料
