【2.6】Gateway克隆

当面临克隆项目时,科学家们不再局限于传统的限制性内切酶克隆。相反,您可以 选择一种在给定资源、时间和实验需求下运行良好的分子克隆技术。自 1990 年代后期发明以来,Gateway 克隆技术作为将 DNA 序列转移到多个载体系统中的一种快速高效的方式已变得非常流行。通过适当的入口和目标载体,人们可以使用 Gateway 将感兴趣的基因克隆到各种表达系统中

Gateway技术简介

由Invitrogen开发的 Gateway 克隆方法是λ 噬菌体感染细菌时发生的整合和切除重组反应的体外版本。 在体内,这些重组反应是由噬菌体 ( att P ) 和细菌 ( att B )附着位点的重组促进的。由于 attP 和 attB 位点之间的重组,噬菌体整合到细菌基因组中,两侧是两个新的重组位点 (att L -left- 和att R -right-,图 1)。在一定条件下,attL和att R位点可以重组,导致噬菌体从细菌染色体上切除,att P和att B位点再生。

Gateway 载体包含att位点的修改版本,因此科学家可以轻松克隆到他们想要的 DNA 序列中。Gateway技术依赖于下面描述的两个反应:

在BP反应取之间发生ATTB sites侧翼插入和ATT P供体载体。该反应由 BP Clonase 酶混合物催化,并生成包含目标 DNA的入口克隆,其两侧是att L位点。作为反应的副产物,从供体载体中切除ccd B基因。

在LR反应取之间发生ATT大号所产生的进入克隆的位点和ATT ř目标向量的位点。该反应由 LR Clonase 酶混合物催化。结果,产生了带有侧翼为att B位点的目标 DNA的 表达克隆。与 BP 反应一样, 包含ccd B基因的 DNA 片段 从目标载体中切除。

一旦进行了 BP 和/或 LR 反应,下一步就是转化感受态大肠杆菌细胞并选择阳性克隆。入口克隆和目标载体携带不同的抗生素抗性标记(此处用质粒颜色表示),让您轻松选择表达克隆。您还需要使用 对CcdB敏感的大肠杆菌菌株(例如DH5α、TOP10、Mach1 )。CCDB基因是存在于供体载体 和目的向量重组前,它与感兴趣期间BP或LR反应中的基因交换。由于 CcdB 蛋白 抑制了 CcdB 敏感的生长大肠杆菌菌株,大多数菌落应包含所需的重组构建体。

如何使用Gateway技术进行克隆

为了更好地理解该过程,我们将通过一个示例实验,在该实验中我们可能会使用 Gateway 克隆来生成我们想要的构建体:人类 KRAS 基因在哺乳动物细胞中的慢病毒表达。

步骤 1:生成条目克隆 Generate an Entry Clone

有几种不同的方法可以生成我们想要的入门克隆——人类KRAS两侧是attL位点。

方法 A:将att B - PCR 产物或质粒与att P供体载体重组。在这种情况下,我们将使用 PCR 将att B位点添加到KRAS编码序列的任一端。如果您选择此策略,重要的是要包含正确的蛋白质表达元件(核糖体识别序列、起始密码子、终止密码子、阅读框注意事项等)。该视频演示了如何使用Snapgene 程序 设计Gateway 质粒。

方法 B: 将所需插入片段的TOPO 克隆到att L -entry-TOPO 载体中。TOPO 克隆添加了短端以促进克隆到包含att L的入口载体中。

方法 C:限制性克隆包含目标 DNA 和att L入口载体的限制性内切酶片段。该片段被插入到含有att L的入口载体的多克隆位点 (MCS) 中。

专业提示: Addgene 还为许多流行基因提供现成的入门克隆,包括Hs.KRAS4a

步骤 2:生成表达式克隆

在制作表达克隆时,选择最适合您的实验的目标载体很重要。这种选择将取决于许多因素,例如您的生物体、所需的表达水平和实验目的。对于哺乳动物慢病毒表达,我们可以使用像pLenti CMV Puro DEST (w118-1)或强力霉素诱导的pLIX_402 这样的载体。所选择的ATT ř目的载体将重组的在吨大号-entry克隆来创建表达克隆。

第 3 步:表达您感兴趣的基因! 请务必通过测序或限制性消化来验证您的表达克隆的完整性!然后,您可以转化或转染您想要用于实验的细胞,并验证您的构建体是否具有功能。

Gateway 克隆方法的优点

  • 兼容性和灵活性

    • 使用感兴趣的 DNA 序列生成入门克隆后,只需一个重组步骤,您就可以在任何表达系统中移动该 DNA 片段。Addgene 的现成入门克隆可用于多种质粒。
  • 速度

    • Gateway 系统仅在 1 天内即可生成表达构建体,而传统的限制性和连接克隆需要 2 天以上。还可以在同一管中设置 BP 和 LR 反应,加速att B- PCR 产物直接克隆到目标载体中。克隆过程很简单——不需要限制、连接或凝胶纯化步骤!
  • 多片段克隆

    • 您可以使用 Gateway 克隆将多个 DNA 片段一次插入到同一管中的多个载体中。您最多可以将 4 个 DNA 片段以特定顺序和方向在一个管中克隆到一个 Gateway 载体中,以产生所需的表达克隆。由于Gateway向量的设计,这成为可能。他们修改了att B、P、L和R位点的版本,这些位点非常特异性和定向地重组:att B1位点仅与attP1 位点发生反应;attB2 仅与attP2,attL1 仅与attR1;attL2 仅与attR2,依此类推。看看一些可在Addgene公司的Gateway多地点质粒,包括弗鲁实验室的多慢病毒表达系统(MULE)试剂盒,该多点会议Gateway克隆试剂盒,以及多站点Gateway质粒。
  • 恒定阅读框

    • 当您将 DNA 片段从一个 Gateway 载体移动到另一个载体时,插入的 DNA 片段会保持在框架内。
  • 高效率

    • 用于 Gateway Cloning 的阳性(抗生素)和阴性 (CcdB) 选择标记可将克隆效率提高至 >99%。
  • 普遍性

    • 可以克隆所有类型的 DNA 片段:PCR 片段、cDNA 或基因组 DNA,可用于从哺乳动物到大肠杆菌的所有生物体

Gateway 克隆载体词汇表

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

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