【6.1】基因组工程简介
基因组工程不仅可以剖析复杂的基因相互作用，还可以通过合成生物学建立新的途径。 在过去的几十年里，基因组工程技术的数量和可行性取得了巨大的进步。
基因组工程诞生于 1970 年代后期，当时多个研究小组表明外源 DNA 可以被酵母或细菌吸收并随机整合到基因组中。 随后的工作表明，这个过程也可以有针对性地发生。 Addgene 保藏者 Mario Capecchi 意识到将 DNA 显微注射到细胞核中会刺激细胞同源重组，从而实现靶向基因组修饰。 1989 年，他、Martin Evans 和 Oliver Smithies 创造了第一只基因敲除小鼠，这是基因组工程的分水岭。
Cre-Lox
1980 年代后期也标志着 Cre-lox 重组的引入，这是一种源自 P1 噬菌体的系统，现在广泛用于控制基因表达。 今天，Cre 重组酶在各种启动子的控制下，或其诱导形式，提供了对基因表达的复杂时空控制，尤其是在小鼠转基因中。
同源重组与 CRISPR/Cas9 之旅
Homologous Recombination and the Journey Towards CRISPR/Cas9
同源重组是基因组工程的基石，但需要注意的是，它以低频率发生，限制了编辑效率。 为了提高编辑率，研究人员劫持了核酸内切酶的功能，它会产生难以修复的 DNA 双链断裂。 将这些酶靶向给定基因座会导致 DNA 切割，并迫使细胞进行非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR)。 如果没有提供 DNA 修复模板，就会发生 NHEJ，其容易出错的性质通常会导致失活突变。 在 HDR 的情况下，修复模板指定所需的基因组修饰，从而实现精确编辑。 除了引入点突变或重组位点外，修复模板还可用于将感兴趣的基因引入给定基因座。
Zinc Finger Nucleases
锌指核酸酶 (ZFN, Zinc nger nucleases) 代表了迈向高效、靶向核酸酶的第一步。 为了创建 ZFN，设计了一系列锌 fingers 以结合特定基因组位点，然后与 FokI 核酸酶融合。 识别两个相邻位点的配对 ZFN 切割 DNA，启动 HDR。 ZFN 的效用受到其长合成时间和非模块化组装过程的限制。 尽管计算工具有助于改进靶向，但不可能为每个基因组位点设计合适的 ZFN 对。
TALENs
TALENs 于 2011 年首次报道，代表着基因组工程向前迈进了一大步。 该模块化系统基于 TAL 效应 DNA 结合蛋白，从黄单胞菌属中分离，与 FokI 核酸内切酶融合。 一位经验丰富的科学家可能需要六周时间才能制作出 ZFN，而一个新手可以在短短几天内制作出一个 TALEN！ TALEN 技术迅速被研究界采用，Golden Gate TALEN 试剂盒成为 Addgene 最受欢迎的试剂盒。 TALENs 的可定制 DNA 结合特性还支持设计定制转录因子来调节基因表达。
CRISPR
就在我们认为基因组工程不可能变得更好的时候，CRISPR（成簇的规则间隔短回文重复序列）/Cas9 系统出现了。 CRISPR 是细菌免疫系统的重要组成部分，可让细菌记住和破坏噬菌体。 在基因组工程应用中，Cas9 核酸内切酶通过引导 RNA (gRNA) 序列同源性靶向给定基因座，在那里诱导双链断裂。 与 ZFNs 和 TALENs 一样，CRISPR/Cas9 使用 HDR，但使用 RNA 来指定编辑使系统更便宜和耗时，并且更精确和可扩展。 出于这个原因，CRISPR/Cas9 已被证明对于高通量基因组工程非常有价值。 CRISPR/Cas9 还可以针对一个生物体中的多个基因座，并且与 TALEN 一样，该系统也适用于其他功能。 与 TALEN 相比，CRISPR 对研究界来说更容易获得，每周都会发布使用该技术的新论文。
其他重要的基因组工程工具
随着 CRISPR 的成功，很容易忘记其他基因组工程方法……但你不应该！ 另一种基于 HDR 的方法，重组工程，通常用于大肠杆菌中，以对基因组或细菌人工染色体 (BAC) 进行编辑。 修复模板上的 50 bp 同源臂指定了由噬菌体重组酶催化的重组位点。 由于可以使用 PCR 快速生成修复模板，因此重组工程可以像 CRISPR 一样轻松扩展。 除了在细菌基因组工程中的应用外，重组工程还可用于为其他 HDR 基因组工程方法创建基于 BAC 的修复模板。
在 HDR 之外，一种令人兴奋的新基因转移方法是睡美人转座子(Sleeping Beauty transposon )，从古代鱼 的化石重建。 转座子是可移动的 DNA 元件，因此是基因转移的理想选择。 该系统分为两个质粒，一个包含由反向重复序列连接的目的基因 (GOI)，另一个携带转座酶。 共转染后，转座酶从质粒上切割 GOI 并促进双链断裂，使 GOI 整合到基因组中。 睡美人被评为 2009 年的年度分子，它代表了病毒载体介导的基因转移的强大替代品。
结论
凭借触手可及的多种稳健高效的基因组工程方法，我们进入了基因组工程的黄金时代。 当前的工作重点是改进这些技术以确保高特异性和活性，无论所需的目标位点（或位点,locus or loci）是什么，希望这些方法在临床上有用。
参考资料
