【6.3】敲除/敲入质粒
研究基因功能的最有效策略之一是通过用实验室设计的一段 DNA 替换或破坏基因来灭活或“敲除”基因。特殊构建的质粒可用于通过同源重组替换酵母、小鼠或果蝇中的基因。这个概念很简单：将带有修改版本的目标序列的模板传送到细胞中，细胞将与内源基因重组模板。在这里，我们将描述用于灭活哺乳动物细胞中特定基因的技术和质粒。尽管基于 CRISPR 的敲除/敲入很流行 系统，这些系统仍然很有价值，尤其是在无法使用 CRISPR 的情况下（例如附近没有合适的 PAM 序列或您的目标基因难以用 gRNA 特异性靶向）。在选择knockout策略时，请务必牢记这些技巧！
敲除质粒
同源重组 是一种准确修复有害双链断裂的机制，其中核苷酸序列在两个相似或相同的 DNA 分子之间交换。基因打靶利用这种自然过程，使用包含与目标基因座同源的序列的专门设计的载体，用同源序列替换目标基因座。为了让您了解这个过程，我们将介绍一个旨在敲除给定基因的外显子 2 的实验。
- 设计您的定位结构。为了在细胞中发生重组，至少需要 2 kb 的序列同源性，但 6 到 14 kb 的同源性对于靶向构建体来说是典型的。在图 1 所示的示例中，对应于目标基因的外显子 1 和 3 的大序列已被克隆到抗生素抗性基因两侧的载体中. 为避免选择构建体随机整合到基因组中的细胞，在同源臂之一的外部包含了一个负选择标记，如 HSV 胸苷激酶 (HSV-tk)。当我们稍后选择细胞时，我们将首先对抗生素抗性基因进行阳性选择，然后对阴性选择标记进行反选择——后一步将杀死许多随机整合了全部或大部分质粒的细胞.
- 将您的构建体传送到您的目标细胞。重组后，目标基因的外显子2会从染色体上被去除，并被抗性基因取代。基因因此被破坏或敲除。
- 使用阳性和阴性选择来找到正确重组的细胞。重组是一种罕见的事件，因此您必须选择而不是筛选发生重组的细胞。新霉素、嘌呤霉素和潮霉素抗性基因通常用于阳性选择。当正选择标记选择重组时，负选择标记选择不正确的、随机的重组到不同的基因座。正确重组的细胞不会包含负选择标记，但随机重组的细胞可能会将负选择标记整合到基因组中。这种非同源重组的最终产物可以在正选择中存活下来，但对负选择很敏感。
- 删除正选择标记。由于抗生素抗性基因会影响细胞的表型，研究人员通常在使用Cre/Lox 重组系统进行选择后将其移除 。在通过插入侧翼 LoxP 序列“floxing”抗性基因后，您可以通过添加 Cre 重组酶去除该基因（图 2）。
敲除/敲入质粒
基因打靶方法还可以将任何基因、标签或突变的外显子插入或敲入基因组。为此，将要插入的序列与阳性选择标记一起克隆到同源序列之间的载体中。为了敲除给定的基因并将GFP插入基因组，我们将创建一个类似于下图所示的质粒，其中 GFP 的序列与新霉素抗性 (NeoR) 基因一起克隆在外显子 1 和 3 之间目标基因。重组后，GFP/NeoR 盒被插入代替外显子 2。因此，靶基因被破坏（敲除），但插入的 GFP 被表达（敲入）。如上例所示，您可以使用 Cre 重组酶去除 floxed 抗性基因。如果 GFP 受到内源性启动子的控制，您可以使用表达 GFP 来跟踪参与发育或所选启动子响应的其他病理生理事件的细胞。您也可以使用此方法与GFP标记内源性蛋白，如在蓝色火焰质粒OCT4-EGFP-PGK-普罗从詹尼士实验室。
有条件淘汰赛 Conditional knockouts
前面部分中描述的方法和质粒是敲除非必需目的基因的简单方法。但是，如果您感兴趣的基因是必不可少的，那么真正的敲除可能是致命的，而您反而想要创建一个 有条件的敲除。
为了进行有条件的敲除，研究人员经常使用前面描述的 Cre/Lox 系统。在这种情况下，您可以设计靶向载体，使一组三个 LoxP 位点位于抗性基因和感兴趣基因中的靶向外显子的两侧（图 4）。当重组发生时，该基因仍能正常发挥作用，因为它的一个外显子已被 LoxP 位点两侧的相同序列替换，而抗性盒已放入内含子。
重组发生后，您将首先使用 Cre 重组酶去除抗性标记。由于有 3 个 loxP 位点，重组可以通过多种方式发生。所需的重组事件将仅去除 NeoR 并保留外显子 2 浮动，如图 4 的第 4 行所示。由于 loxP 位点位于内含子区域，因此该基因仍将被表达。您首先使用 PCR 筛选这种特定的重组结果，然后生成带有 floxed 外显子的单克隆细胞系。然后，您可以通过第二轮 Cre 重组有条件地去除该外显子（从而敲除该基因）。
基因敲除质粒的未来
尽管这些方法已被用于创建许多敲除细胞系和动物模型，但它们的效率非常低，从检测不到到 0.1%。相比之下，CRISPR 等新的基因组编辑技术更易于使用，并且在灭活基因方面更有效。CRISPR 可以靶向基因组序列并创建可以使用修复模板通过同源重组修复的断裂。这些模板可以包括要创建的 loxP 站点 条件 floxed 等位基因。尽管 CRISPR 非常擅长敲除，但敲除大段 DNA 可能更加困难。
很难相信第一只基因敲除小鼠诞生于 1989 年，也就是不到 30 年前。随着传统敲除和新 CRISPR 工具的不断完善，细胞和小鼠敲除系的产量应该会增加。新的基因组工程工具也为在以前难以设计的物种（如大鼠）中创建新的基因敲除动物模型提供了希望。
参考资料
