【4.7.3】荧光素酶互补法(LCI, nluc/fluc)

由于该实验操作简便,已经成为植物蛋白互作验证中被广泛使用的检测方法之一。

一、背景介绍

基于荧光素酶(Luciferase)的发光原理,形成了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海参荧光素酶(Renilla luciferase)。两者可与各自的底物发生氧化作用产生生物荧光,产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。

Firefly luciferase和Renilla luciferase被称为报告基因,是因为在表达调控研究时,利用两者表达产生的荧光比值可监控微观层面上的分子间相互作用。

具体做法:将靶基因的的转录调控元件或5’启动子区融合在Firefly luciferase基因的上游,把3‘-UTR区或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游,以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用,或miRNA对目的基因/IncRNA的调控作用。

该系统中引入Renilla luciferase基因的TK载体作为内参,以消除细胞转染等因素带来的组间误差。

其中luciferase来源于细菌、萤火虫和发光海洋生物等,可以在哺乳动物细胞和植物细胞中直接表达,无需表达后修饰,直接具备完全酶活性。

与GFP不同之处在于luciferase的发光检测不需要激发光激发,且发光穿透力更强,这使得Luc实验具备可定量、高灵敏度及背景低等特点。

最初开发用于检测哺乳动物活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用,但后来被用于植物的研究中。借助于烟草的瞬时表达系统,将含有融合蛋白的表达载体转化农杆菌后注射烟草叶片,培养2-3天后,在注射部位均匀涂抹反应底物。通过植物活体成像系统和高灵敏度发光检测仪检测生物发光的强度,从而对蛋白之间的相互作用进行定性和定量分析。此方法已被广泛应用于动植物相关领域的蛋白质互作研究。

二、原理

将荧光素酶蛋白分为N端和C端2个功能片段, 即NLuc和CLuc。待测的2个目的蛋白分别与NLuc和CLuc融合。当2个目标蛋白相互作用将NLuc和CLuc紧密结合,恢复荧光素酶的催化活性,促使荧光素酶底物氧化而发光。

在验证植物蛋白互作时,荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究[2]。

目前, 应用最为广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。

实验中, 荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段, 即NLuc (2–416AA)和 CLuc (398–550AA)。

在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。

三、实验方法

① 分别将待测蛋白质的基因克隆到含有CLuc和NLuc编码序列的质粒中,然后将所得质粒转入农杆菌中。

② 将含有这两种质粒的农杆菌细菌浸入本氏烟草中,以便重组DNA可以被传递到植物细胞中并稳定表达。

③ 收集表达测试蛋白质的叶组织,通过植物活体成像系统和高灵敏度发光检测仪检测生物发光的强度,从而对蛋白之间的相互作用进行定性和定量分析。

将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌 (Agrobacterium) 后注射烟草叶片。24–48小时后,加入反应底物荧火素, 利用植物活体分子影像系统 (CCD imaging system) 或luminometer来定性定量检测荧光强度, 以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度。

四、讨论

4.1 优缺点

优点:

① 高度定量,允许在几个数量级的范围内对发光信号进行线性测量。

② 与FRET和BiFC相比,此法可对整个组织或细胞群进行采样,避免了来自单个细胞的偏差。

③ 在黑暗中测量发光,不受叶绿素和细胞壁产生的自荧光的影响。

④ 可用于在组织水平上研究蛋白质-蛋白质相互作用,该技术对于研究组织特异性蛋白质-蛋白质相互作用非常有用。

⑤ 无需显微镜,通过使用植物活体成像系统和板式发光检测仪可以在1-2分钟内收集数据,进行定性和定量分析,同时检测大量的蛋白质组。

⑥ 需要最少的样品处理和实验室培训,操作简便,实验高效。

⑦ LCI作为植物蛋白质相互作用研究的简单工具的可用性将有助于验证从酵母双杂交分析中收集的蛋白质相互作用组数据。

4.2

萤火虫萤光素酶(Fluc)是SLC技术中最常用的萤光素酶,但Fluc的N端和C端片段体积过大,在某些情况下可能会干扰融合蛋白的功能或互作。

Nano萤光素酶(Nluc)是目前已知体积最小的萤光素酶,且萤光强度优于目前已知的所有萤光素酶。该研究尝试利用Nluc 159个氨基酸的N端片段和11个氨基酸的C端片段构建SLC策略,且在这两个片段末端分别融合HA或FLAG蛋白标签,从而使获得的载体系统既可用于SLC检测,又可用于免疫共沉淀。

参考资料

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