【6.7】Sleeping Beauty

转座子是可以在基因组中移动的 DNA 序列。在实验室环境中,转座子可用于将基因引入生物体的基因组(见图)和破坏插入位点的内源基因。在这两种情况下,转座子结合了病毒和裸 DNA 的优点,同时消除了一些缺点。具体来说,病毒能够感染宿主细胞并在宿主细胞中复制,但它们容易受到细胞防御机制的影响。使用非病毒载体,如转座子,可以避免许多(尽管不是全部)这些防御。对于基因组工程的某些应用——例如某些形式的基因治疗——出于社会和监管原因,避免使用病毒也很重要。

1.) 转座子由一组镜像的反向重复(绿色)组成,位于质粒骨架中感兴趣的基因(蓝色)的两侧。一个单独的质粒包含转座酶基因(红色),用于表达转座酶。 2.) 转座酶被表达(红色星)并结合反向重复(绿色);并且会发生核酸内切酶反应,从而切割 DNA。 3.) 释放的转座子现在可以结合一条带有 TA 二核苷酸的 DNA 链(人类基因组中有许多这样的位点)。去除转座子后原质粒为空;然后质粒被细胞降解。 4.) 转座酶在 DNA 中产生双链断裂并允许转座子整合。此外,TA 序列在感兴趣的基因插入位点附近被复制。

睡美人转座子系统 The Sleeping Beauty transposon system

睡美人 (SB,Sleeping Beauty) 转座子系统就是这样一种系统,其设计用于在脊椎动物中进行基因转移。该系统由两部分组成:1) SB转座酶,催化转座所需的酶;和 2) 一个包含基因表达盒的转座子,可以在基因组内进行易位。睡美人转座酶得名于它是从鱼类中发现的有缺陷的转座酶重建而来的。这种转座酶已在许多不同鱼类的基因组中以各种非功能形式被发现,据信已有数百万年的历史。第一个功能性 SB 系统是通过融合和修饰各种已灭绝的转座酶合成的。

1997 年开发的睡美人转座子 (SB10) 的基本功能版本不断被改变,以提高其在原代细胞中的基因插入效率。2009 年,Zsuzsanna Izsvak 的实验室在哺乳动物细胞中筛选了许多 SB 转座酶变体的过度活跃。他们的努力产生了一种新的和改进的 SB 转座酶SB100X,其效率比第一代转座酶高约 100 倍(通过在 HeLa 细胞中进行的抗生素抗性基因的转座测定确定)。在他们的Nature Genetics论文中,该实验室表明,使用 SB100x 的稳定基因转移效率与整合病毒载体的稳定转导效率相当。

新的睡美人转座酶载体 New Sleeping Beauty transposase vectors

最近,Eric Kowarz 的实验室为 SB 转座酶系统开发了两种新型载体——一组用于稳健组成型表达的载体(pSBbi 衍生物)和一组用于诱导表达的载体(pSBtet 衍生物)。组成型和诱导型表达载体被开发成 16 种具有不同选择标记(杀稻瘟素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素)和荧光蛋白报告基因(GFP、BFP、RFP、无 FP)的变体。每个向量包含两个SfiI具有不同突出端的限制性位点取决于它们是在目标基因的 3’ 端还是 5’ 端,允许以正确的方向插入。这些质粒使用新的合成 RPBSA 启动子,该启动子由与 RPL41 基因区域融合的 RPL13a 启动子片段组成,以驱动每个构建体的选择/报告部分。这种新的工具包允许快速生成稳定的转基因细胞系,这些细胞系可以稳定地表达您的目标基因,无论是组成型的还是受强力霉素调节的。

睡美人转座酶被证明是一种令人兴奋的工具,可以在不使用病毒载体的情况下产生特定的基因突变和基因破坏。2009年,它被评为年度分子。此外,2014 年,MD 安德森癌症中心的研究人员公布了一项临床试验结果,该试验使用睡美人转座酶作为 CD19 定向嵌合抗原受体 (CAR) 治疗的非病毒载体。SB 是一种有价值的工具,也是用于基因组工程的 CRISPR 的替代品,其使用在未来几十年可能会增长。

参考资料

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