【2.3】TOPO 克隆

基于拓扑异构酶的克隆 (TOPO cloning;Topoisomerase based cloning) 是一种 DNA克隆方法 ,不使用限制酶 或连接酶,并且不需要 PCR 后程序。听起来很简单吧?该技术依赖于互补碱基对腺嘌呤 (A) 和胸腺嘧啶 (T) 杂交并形成氢键的基本能力。这篇文章主要关注“粘端”( “sticky end”)TOPO(也称为TOPO-TA)克隆;然而,TOPO 克隆技术也适用于平端克隆

那么TOPO克隆是如何工作的呢?

如下图所示,蓝色 PCR 产物插入片段上的“A”突出端来自使用 Taq 聚合酶进行扩增步骤,因为 Taq 聚合酶在 PCR 产物的 3’ 端留下单个脱氧腺苷 (A)。配对中的互补“T”来自拓扑异构酶 I 线性化主链。DNA 拓扑异构酶 I(描绘为绿色云)通过切割和重新连接超螺旋 DNA 末端以促进复制,既可用作限制性内切核酸酶,也可用作连接酶。

TOPO 克隆载体TOPO 技术专门使用痘苗病毒分离的拓扑异构酶 I,因为该酶识别 DNA 序列 5´-(C/T)CCTT-3’ 并在该序列上消化双链 DNA。这种断裂产生的能量以共价键的形式储存在切割的 3’ DNA 链和拓扑异构酶 I ( 1 )的酪氨酰残基之间。如果来自不同 DNA 链的 5’ 羟基出现,它可以攻击这种共价键,从而连接两条 DNA 链并释放拓扑异构酶 ( 2 )。

如今,市售的 TOPO 试剂盒提供的载体或克隆臂带有与拓扑异构酶共价连接的悬垂 3’ 脱氧胸苷 (T) 残基。这些试剂盒中的载体通常还具有插入 β-半乳糖苷酶盒的拓扑异构酶位点,允许研究人员在转化后进行蓝白筛选- 载体末端的自我连接导致产生不需要挑选和的蓝色菌落测序潜在阳性克隆。一旦您引入了您的 3’ 末端“A”悬垂插入物,TOPO 克隆的魔力就会发生。

基本程序 Basic procedure

让我们分解一下 TOPO 克隆所需的步骤:

  1. 创建您的 PCR 产品: 设计标准引物(无需在末端添加独特的限制性位点)并使用您最喜欢的 PCR 方案用 Taq 聚合酶扩增您的目标序列。

  2. 建立 TOPO 克隆反应:将 PCR 产物和 TOPO 载体混合在一起。

  3. 在室温下孵育 5 分钟:如果您打算立即转化,您可以将您的反应放在冰上,或者您可以将反应在 -20C 下储存过夜。

  4. 将 TOPO 克隆反应转化为感受态细胞:您可以使用您的标准实验室方案;但是,您应该将冰上孵育时间减少到 5 分钟(孵育整整 30 分钟不会显着提高转化效率)。

  5. 选择并分析 10 个白色或浅蓝色菌落:您可以通过 PCR、限制性消化 或测序来确认插入片段的存在。

专业提示 Pro tips

  • 不要在 PCR 引物中添加 5’ 磷酸;你需要那个游离的羟基!

  • 您可能希望在最后一个 PCR 循环之后包括额外的延伸时间,以确保“A”被添加到所有 PCR 产物中。

  • 请记住,Taq 聚合酶的错误率约为 3,500 个碱基中的 1 个。通常使用具有校对功能的聚合酶代替 Taq 来降低错误率;但是,校对聚合酶也会去除 PCR 产物中所有未配对的 3’ 末端。如果您需要降低错误率,请使用以下方法之一来确保您的插入片段保留 3’ A 突出部分:

    • 使用校对酶和 Taq 的混合物,其中 Taq 的使用比例为 10:1。
    • 凝胶纯化您的 PCR 产物,并将其与缓冲液、Taq 和 dATP 在 72C 下孵育 10-15 分钟。
  • 将 PCR 产物与 TOPO 载体混合时,您可能需要在反应中添加额外的盐:

    • 当 PCR 产物和载体连接时,拓扑异构酶 I 从载体中释放出来;然而,它可能会重新结合并切割新连接的 DNA。盐有助于防止拓扑异构酶 I 重新结合,从而产生更完整的分子。(请注意,您添加的盐量取决于您是否计划将您的反应转化为化学或电感受态大肠杆菌 - 过量的盐会导致电穿孔过程中产生电弧,从而导致电穿孔失败)。
  • 在室温下孵育时,不建议您超过 5 分钟的时间限制(据报道,孵育时间越长转化效率越低);但是,如果您的 PCR 产物浓度较低或者您要克隆一个非常大的插入片段,则可能需要孵育 20-30 分钟。

  • 由于标准连接反应相当快,因此在继续之前,请确保您保持井井有条并准备好下一步所需的一切。

在接种转化前预热含抗生素的培养板可能会让您在 8 小时内看到菌落。

参考资料

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